16SrDNA的提取、纯化及测序

3.6 16S rDNA的提取、纯化及测序 3.6。1 基因组DNA的提取与纯化

（1）摇菌过夜30℃、180r/min摇床振荡培养8~12h；

(2）沉淀菌体,取菌液于1。5mL EP管中5000r/min离心5min,无菌水洗涤1~2次； (3)400μL TE重悬菌体,加入20μL溶菌酶(50mg/ml)，37℃过夜；

（4）加400μL CTAB提取液，轻轻摇匀，65℃水浴40min（每10min轻摇一次）；

（5）冷却至室温，加400μL酚-氯仿(1:1)，轻轻摇匀，12000r/min，4℃离心10min； （6）吸取上层清液，加400μL氯仿,轻轻摇匀，12000r/min，4℃离心10min；

（7）吸取上层清液，加入等体积冰冻异丙醇，轻轻摇匀，—20℃静置30min～24h沉淀DNA，12000r/min，4℃离心20min；

(8）小心倒掉水相，75%乙醇洗涤2次，风干。

（9）200μL TE溶解沉淀，加入20μL RNA酶（20mg/ml），37℃保温30min,以等体积的酚—氯仿和氯仿各抽提一次；

（10）吸取上清液,加入1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2）和2倍体积的无水乙醇，轻轻摇匀至出现絮状沉淀，1000r/min离心30min；

(11）倒掉上清液，用75％乙醇洗涤DNA沉淀2次，风干。加入20~30μL TE缓冲液，—20℃保存待用。

3。6。2 16S rDNA的扩增和序列测定

将提出的基因组DNA进行琼脂糖电泳检测，验证有目的产物后，用特定的引物进行16S rDNA的分离及15倍体系的PCR扩增，并电泳检测,将样品放入4℃保存待用。

扩增条件：

Step1 94℃ 5 min Step2 94℃ 30 sec Step3 57℃ 40 sec Step4 72℃ 90 sec Step5 GOTO Step2 32循环 Step6 72℃ 10 min

扩增体系:

样品DNA 1 μL 10×Taq buffer 1.5 μL 2。5 mmol/L dNTP 1.3 μL 引物1：1495 R 0.5 μL 引物2：27 F 0。5 μL Taq酶（2。5 U/µL） 0。4 μL

加双蒸水 15 μL