广西畜牧兽医 2010年Vo1.26(1) 59 多重PCR技术在寄生虫病诊断上的应用及其建立方法的浅析 石云良,黄维义,张为宇 ,施维,王树艳 (广西大学动物科学技术学院,南宁530005) 中国分类号:¥854.42 文献标识码:B 文章编号:1002—523512010)01—0059一O2 对于未知病原体感染和多病原体的混合感染, 应用常规P(、R方法往往需要多次扩增筛选,相对 540bp和392bp。用建立的多重PCR技术对39份 样品进行检测,结果发现该方法的检测结果与原先 费时、费力。而多重PCR能够在同一反应体系内 扩增多个靶序列,可进行多病原体的快速鉴定。目 前多重PCR技术已广泛应用于病毒性、细菌性疾 病的临床诊断,在寄生虫病诊断方面,多重PCR的 应用也日渐增多,应用前景广阔。 1 多重PCR在线虫诊断上的应用 Zarlenga等(2001)l j根据线虫内外转录间隔 区序列(ITS和 rs))设计了5对特异性弓l物,建 立了可同时鉴别诊断五种造成重大经济损失的牛 胃肠道线虫病的多重PCR方法,可特异性扩增奥 氏奥斯特他(氏)线虫(257 bp)、帕莱斯(氏)血矛 线虫(176 bp)、辐射结节线虫(329 bp)、蛇形毛圆 线虫(243 bp)和点状古柏线虫(151 bp)。每种样 品的模板最低检测量仅为20 Pg,不仅可以鉴别不 同成虫基因组DNA,也可以区别实验动物感染的 虫卵种属。剪股颖粒线虫、小麦粒线虫和维氏粒线 虫是3种重要的植物病原线虫,它们在成熟种子和 虫瘿中的虫态通常是幼虫,而这3种线虫的幼虫形 态非常相似,难以根据其特征对它们进行快速准确 的种类鉴定。马以桂等[ J根据这3种线虫的rD— NA—IST区域序列,设计3对特异性引物,建立了 多重PCR检测体系,获得3种线虫的特异性片段, 大小分别为499bp、617bp和377bp。 2 多重PCR在原虫诊断上的应用Figueroa等 建立了牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝 斯虫和牛边缘边虫的多重PCR诊断技术,扩增的 片段大小分别为350bp、278bp和200bp。同时还 具有较好的敏感性。Alhassan等[ ]根据18S rRNA 基因的特征设计特异性二重PCR引物,可同时鉴 别扩增马巴贝斯虫和驽巴贝斯虫,扩增片段为 基金项目:广西科技攻关项目(桂科攻0719004—3E) * 通讯作者。E—mail:zweiyu@hotrnail.coin. 用来确诊的单重PCR检测结果相一致,该多重 PCR技术提供了一种简便鉴别马巴贝斯虫和驽巴 贝斯虫的手段。微孢子虫是引起HIV感染者或艾 滋病患者腹泻的重要病原体。2004年Verweij 建立了能够同时检测粪便中拜氏微孢子虫和脑炎 微孢子虫属的多重实时PCR诊断技术,以溶组织 内阿米巴、迪司帕阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫、小球隐 孢子虫、环孢子虫、产气肠杆菌等22种常见的病原 菌和寄生虫作为对照,发现这两对引物未与对照的 22种病原发生交叉扩增,用建立的多重PCR方法 对140份确定虫体的粪便样品进行检测,结果与镜 检的相一致。 3 多重PCR在绦虫诊断上的应用 Gonzalez等【6j根据牛带状绦虫和猪带状绦虫 的HDP2基因的特征,设计多重PCR鉴别诊断引 物,两种绦虫分别产生600bp和170bp目的带。 2004年Yamasaki等 J根据绦虫的细胞色素C氧 化酶亚基I基因建立了鉴别诊断牛带绦虫、亚洲带 绦虫、美国/-:IE洲和亚洲的猪带绦虫的多重PCR诊 断方法,扩增片段分别为827bp、269bp、720bp和 984bp,该方法只需要30~50mg的样品量就可以 进行检测,不仅适用于绦虫病和囊虫病的检测,也 适用于这几种病的分子流行病学调查。 4 多重PCR在吸虫诊断上的应用 Thanh等_8』根据支睾吸虫和后睾吸虫的线粒 体DNA序列建立支睾吸虫和后睾吸虫的二重 PCR鉴别诊断技术,扩增片段的大小分别为612bp 和1357bp,敏感性试验表明该技术的最低检出量 为0.78ng。成虫、尾蚴、虫卵的DNA都可以进行 检测,可以用来鉴别检测鱼中支睾吸虫的囊蚴或是 人体中感染的成虫和虫卵。 广西畜牧兽医 5建立多重PCR诊断技术要点的浅析 多重PCR诊断技术建立的过程中最关键的步 骤就是诊断引物的设计,现在用于引物设计的软件 也比较多,最常用的是oligo 6.0和primer 5.0,还 可以在线进行引物设计如NCBI上的primer— BLAST等。多重PCR引物的集合可以分为两种: 一种是引物均为自己设计合成;另一种是多重引物 中的某一条是已报道引物,需要自己设计合成其他 的引物。对于这两种情况我们都可以使用oligo 6.0或是primer 5.0设计单条引物,然后进行组合 的筛选,筛选条件除了符合一般弓l物设计的原则 外,多重引物的Tm值应比较相近,各引物之间没 有明显的连续错配和结合。另外引物设计软件 primer express 2.0也可用于多重PCR引物的筛 选,该软件里面有专门用于多重PCR引物的设计 (multiplex PcR),当你输入两个或两个以上的序 列片段时,它会自动筛选最优的多重引物组合,但 其缺点是软件自动在整个序列之内进行筛选,因此 要求输人的靶DNA序列具有较高的特异性。 除引物设计外,反应条件的优化是另一个重要 影响因素。退火温度、氯化钾浓度、镁离子浓度、引 物浓度、扩增的时间和循环数等均会影响反应的扩 增。Henegariu等_9 J指出,多重PCR诊断方法的优 化过程中,退火温度以及反应体系中氯化钾的浓度 是决定反应特异性的最重要因素,反应中氯化镁的 浓度需和dNTP的浓度相适应,引物浓度和扩增的 循环数在一定的范围内没有很明显的区别。因此 在建立多重PCR诊断过程中,应摸索出最适合的 退火温度和氯化钾浓度,以及相匹配的镁离子和 dNTP的浓度。此外建立的多重PCR诊断方法需 应用于一定数量样品的检测,加以验证。 6展望 多重PCR技术不仅应用于寄生虫的诊断,在 寄生虫的基因分型以及药物位点筛选等方面也已 得到了广泛应用[10,11],尽管普及还有一定的困难, 首先多重PCR的各对引物之间存在一定的竞争性 结合各种反应组分,在很多情况下多重PCR比单 重PCR的敏感性稍低一些。此外PCR技术自身 的要求和操作人员的技术水平等原因也限制其推 广和普及。但是随着分子生物学技术的不断发展, 该技术一定会得到进一步完善和推广。 2010年Vo1.26(1) 参考文献 [1]Zarlnega D.S.,Chute M.B.,Gasbarre L.C.,et a1.A multiplex PCR assay for diferentiating economically im— portant gastrointestinal nematodes of cattle[J].Veterinary Parasitok ̄r,2001,97:199 209. [2]马以桂,王金成,谢辉.3种粒线虫多重PCR检测方 法[J].植物病理学报,2006,(6)36:508--511. [3]Figueroa J.V.,Chieves L.P.,Johnson G.S.,Buening G.M.Multiplex polymerase chain reaction based assayfor the detection of Bahesia bigemina,Babesia boris and Anaplamm marginah DNA in bovine blood[J].Vet Para— sitol,1993,50:69~81. [4]Amassan A.,PttmidonmingW.,OkamuraM.,et a1.De— vdopment of a single—‘round and multiplex PCR method for the simultan ̄oL13 detection of Babesia cabaali and Babesia equi in horse blood[J].Veterinary Parasitology, 2005,129:43 49. [5]Verdi J.J.,HoveR.T,BrienenA.T.,LisehoutLV. Multiplex detection of Enterocytozoon bieneusi and En— ecphalitozcon spp.in fecal samplse using real—time PCR [J].Diagnostic Microbiology and Infecitous Disease, 2007。57:163~167. [6]Gonzalez L.M.,ViUalobos N.,Montero E.,et a1.Dif. ferential mol ̄ular identifiaction of Taeniid spp.and ̄arco— cystis spp.cystsisolatedfromi ̄ected pigs andcattle{J]. Veterinary Parasitology,2006,3665:1--7. [7]Yamasaki H.,Allna J.C.,Otake S.M.,et a1.DNA iDfferential Diagnosis of Taeniasis and Cysticercosis by Multiplxe PCR[J].journal of clinical microbiology,2004, 42(2):548 553. [8]Thanh Hoa Lea,Nguyen De,David Blair,et a1. Clnoorehis sinensis and Opisthorchis viverrini:Develop— merit of amitochondrial—basedmultiplxePCRfortheiri— dentiifcation and discrimination[J].Experimental Para— sitology,2006,112:109 114. [9]HenegariuO.,HeeremaN.A.,DlouhyS.R.,VanceG. H..Vogt P.H..Multiplxe PCR:Critical Parameters nadStep—by—StepProtocol[J].BioTechniques.1997, 23:504~511. [10]Nowakowska D.,Colno I.,Rmfington J.S.,et a1. Get.typing of Toxopla. ̄aa gondii by Multiplex PCR and Peptide—Based se蝴cal Testing of Samplse from In— rants in Poland Diagnosed with Congenital Toxoplasrnosis [J].journal of dinical microbiology,2006,4(44):1382 1389. [11]张国庆,汤林华,官亚宜.多重PCR技术检测恶性疟 原虫抗药性相关分子标志的方法研究[J].中国寄生虫 学与寄生虫病杂志,2007,6(25):451--456.