GssgGsh测定

谷胱甘肽含量测定

测定原理：

还原型GSH：DTNB能被-SH基团还原，产生等克分子2-硝基-5-巯基苯甲酸。硝基巯基苯甲酸阴离子呈黄色，在可见光412nm波长处有吸收峰，可用于测定巯基

总谷胱甘肽：类上，只不过多了一个辅酶Ⅱ还原体系

利用2GSH的氧化还原DTNB生成2TNB+2H+,氧化后的GSH（GSSG）又被 NADPH还原；在反应中，NADPH量逐渐减少，TNB量逐渐增加，TNB在412nm光吸收增加速率（△A412/min）与总GSH量呈正比。由于GSH和GSSG循环交替，周而复始，总量不变，故称循环法。

仪器：分光光度计

试剂：

1）5%磺基水杨酸

2）磷酸盐缓冲液：0.1mol/l 磷酸钾缓冲液 PH8.0 含1mmol/l EDTA（分子量372）

3） 1mmol/l DTNB（分子量396.35） 用1%柠檬酸钠溶液配制：0.39635

4） 1%柠檬酸钠溶液

5） NADPH（分子量833.4）1mmol/l

6) GR酶液（现配现用）：酶标品 20ul (NH4)2SO4(3.6M)930ul

7） 1mmol/L的GSH（分子量307.33）

注：分子量：EDTA(372),DTNB(396.35) KH2PO4(136.09) K2HPO43H2O(228.22)

样品的处理：取样品，加入５％磺基水杨酸１ml,冰浴迅速研磨匀浆；6000rpm8分钟左右取上清

标准曲线的绘制：（由于测GSH和总GSSG共用了同一个反应，可以绘制一条标准曲线）

GSH(um) 0 20 40 60 80 100

1.0mmol/L GSH(ml)0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

双蒸水 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25

0.1mol/L PBS 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0

DTNB试剂 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

混匀，5min内412nm比色，以双蒸水调零。以标准GSH溶液为X轴，相应的吸光度为Y轴，绘制标准曲线，并求得回归方程

样品液GSH测定：

试剂 测定管 空白管

待测样品液 0.1 0.1

0.1mol/L PBS 4.4 4.4

DNTB 0.5 ------

双蒸水 —— 0.5

混匀，5分钟内，412nm处读取光密度

样品液总谷胱甘肽测定

反应体系：0.1ml 样+0.1mlDTNB+0.1mlNADPH+0.05mlGR+0.65mlPBS

测△A412=（A412）2—（A412）1

对于谷胱甘肽还原酶的用量影响最终测定结果，故每批测定必须同时做标准曲线。

结果计算：

将测得的样品的吸光值带入直线回归方程，可计算样品液的GSH浓度，或由标准曲线上查得样品的GSH含量。对于组织而言，单位以 ug/100mg 组织表示

Note:DTNB(dithiobisnitrobenzoic acid, DTNB)二硫代二硝基苯甲酸

K2HPO4