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五倍子化学组分对脱矿牙釉质再矿化的影响

来源:飒榕旅游知识分享网
广东牙病防治2013年7月第21卷第7期·359·

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(收稿日期:2013-01-26)

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(编辑钟德钰)

五倍子化学组分对脱矿牙釉质再矿化的影响

郑翼

1,2**

**

,邹玲1*,李伟1*

·基础与应用研究·

*

1口腔疾病研究国家重点实验室,华西口腔医院,四川大学,四川成都(610041);2珠海思迈口腔门诊部

【摘要】目的GCE)及其4个化学组分(GCE-A,GCE-B,GCE-研究五倍子多酚性化合物(Gallachinensisextract,

选择脱矿后显

C和GCE-D)对早期牙釉质龋的再矿化作用,初步追踪五倍子促牙釉质再矿化的有效成分。方法

微硬度值为160~180努氏硬度的70个牛切牙釉质样本,随机分为7组,每天进行4次药物处理(1min/次);药GCE-A溶液(GCE-A组),GCE-B溶液(GCE-B组),GCE-C溶液(GCE-C组)物包括4g/L的GCE溶液(GCE组)、

D溶液(GCE-D组)、和GCE-去离子水(DDW组,阴性对照)和1g/L的氟化钠溶液(NaF组,阳性对照)。样本pH循环12d后用显微放射照相定量分析循环前后病损的总矿物丢失量。结果

GCE组的矿物丢失量和病损深度

GCE及其4

A、GCE-B、GCE-C、GCE-D都有明显低于阴性对照组,但仍高于阳性对照组(P<0.05);GCE的4个组分,即GCE-一定的促进脱矿釉质再矿化作用(P<0.05),但效果明显差于相同浓度的GCE(P<0.05)。结论GCE效果最佳。个组分都有一定的促进脱矿釉质再矿化作用,【关键词】五倍子;【主题词】没食子酸;【中图分类号】R781.1

牙釉质龋;

再矿化

牙釉质;

牙再矿化

【文章编号】1006-5245(2013)07-0359-05

龋齿/预防与控制;

【文献标识码】A

*基金项目:国家自然科学基金青年基金(310000581)

E-mail:wszouling@gmail.com

**郑翼,邹玲为共同第一作者***通讯作者:李伟

·360·广东牙病防治2013年7月第21卷第7期

【引用著录格式】郑翼,2013,21(7):邹玲,李伟.五倍子化学组分对脱矿牙釉质再矿化的影响.广东牙病防治,359-363.

EffectofextractandchemicalfractionsofGallachinensisonremineralizationofinitialenamelcariouslesionsinvitro

ZHENGYi1,ZOULing,LIWei.1StateKeyLaboratoryofOralDiseases,WestChinaHospitalofStomatology,

ToevaluatetheeffectoftheextractandthechemicalfractionsofGallachinensisforenemal

Seventybovineenamelblockswithinitialcariouslesionsproducedinvitrowereran-SichuanUniversity,Chengdu610041,China【Abstract】Objective

remineralizationinvitro.Methods

domlydividedintosevengroupsandthenpH-cycledfor12d.Eachdailycycleincludedonefollowingtreatment(1mineachtimeand4timesdaily):1g/LNaF(positivecontrol);deionizedwater(DDW,negativecontrol);and4000ppmA,GCE-B,GCE-C,andGCE-D.Theenamelblocksaqueoussolutionsoffiveexperimentalgroups,i.e.,GCE,GCE-wereanalyzedbytransversemicroradiography(TMR).Mineralcontentinboththesurfacelayerandthelesionbodywereanalyzed.Integratedmineralloss(IML)andlesiondepth(LD)weredeterminedquantitatively.Results

GCEsignifi-cantlyreducedbothLDandIMLcomparedwithDDW(P<0.05).ThesmallestvaluesofIMLandLDwerefoundinthepositivecontrols(P<0.05).TherewasnosignificantdifferenceofIMLandLDamongallthefourfractiongroups(P>0.05).Forallthefourfractions,theyenhancedtheenamelremineralizationtosomeextentbutworkedlesseffectivelycomparedwithGCE.ConclusionsGCE.

【Keywords】Gallachinensis;【MeSH】Gallicacid;

Enamelcariouslesions;

RemineralizationDentalenamel;

Toothremineralizition

Dentalcaries/prevention&control;

GCEanditsfourfractionshadapotentialroletopromotetheremineralizationofini-tialenamelcariouslesionsunderdynamicpH-cyclingconditions.However,allthefourfractionswerenotaseffectiveas

天然药物防龋是近年来龋病防治的研究热点。五倍子又名百虫仓、百药煎、棓子,为同翅目蚜虫科“盐肤木”的角倍蚜或倍蛋蚜雌虫寄生于漆树科植物及其同属其他植物的嫩叶或叶柄,刺伤而生成一种经烘焙干燥后所得。天然药物中囊状聚生物虫瘿,

有效成分或活性化合物的分离鉴定是研究药物防治疾病物质基础的重要环节。本课题组前期研究发现GCE)五倍子多酚性化合物(Gallachinensisextract,的提取物不仅对口腔生物膜细菌有较强的抑制作

[1-9]

。而从GCE中还能促进早期釉质龋再矿化用,

A、GCE-B、GCE-C获得的4个化学组分,分别为GCE-D[6],B抑菌效果最和GCE-经抑菌实验发现GCE-[1]

GCE-B有一定的佳。楚金普等的研究结果表明,

促进矿化作用,但效果不如GCE,提示从抑菌角度筛

B并不一定是其促选得到的五倍子有效成分GCE-进矿化的有效成分。以往研究未系统比较GCE各

成分的再矿化作用,本实验拟通过体外pH循环实验评价GCE及其4个化学组分对早期人工龋的再矿化作用,寻找五倍子调节再矿化作用的活性成分,为进一步深入分析其矿化调节机制提供实验依据。1

材料和方法

1.1GCE及其化学组分的提取

选取四川产五倍子(由四川省天然药物研究重

点实验室提供),提取GCE方法参考课题组前期实[3]

验。将1000g五倍子粉碎后加入3000mL去离DDW),置于60~子水(distilledanddeionizedwater,

70℃水浴10h,过滤,脱色,浓缩,再加体积分数95%乙醇溶液,浓缩得GCE。取GCE15g,以葡聚糖20(安玛西亚上海公司)为分离材凝胶SephadexLH-料进行梯度洗脱。依次以DDW1500mL、体积分数30%乙醇溶液1500mL、体积分数50%丙酮溶液1500mL、丙酮1500mL洗脱,分别减压浓缩至干A)2.3g、燥,得五倍子A(水组分GCE-五倍子B(30%乙醇组分,GCE-B)2.7g、五倍子C(50%丙酮

GCE-C)7.0g、GCE-D)组分,五倍子D(丙酮组分,1.2g[6]。1.2

牛牙釉质样本的制备

[3]

制备方法参考课题组前期实验。选择新鲜拔除的牛切牙,去除根部软组织,用氧化铝糊剂磨去釉

质表面的菌斑和色素,冲洗干净后贮存于4℃含有质量分数0.05%麝香草酚的DDW中备用。实验时取出,切除牙根,牙冠超声清洗,干燥,体视显微镜(放大10倍)下观察无龋损、氟斑、裂痕。用高速硬组织切割机将牙冠切成长4mm、宽4mm、厚2mm大小的釉质块,唇面釉质用抛光机及粒度6.5μm、2.5μm碳化硅砂纸在流水下依次磨平、抛光,去除

釉质块表面开窗大小为表层约150μm。自然干燥,

广东牙病防治2013年7月第21卷第7期·361·

4mm边长的方形,其余部位涂布两层抗酸指甲油。1.3

人工龋实验

将预备好的釉质样本用指甲油固定在环形玻棒上,放入盛有脱矿溶液的玻璃器皿中。人工龋脱矿液的成分为:2.2mmol/LCa(NO3)2溶液、2.2mmol/LKH2PO4溶液、50.0mmol/L醋酸溶液、5.0mmol/LNaN3溶液、0.5mg/LNaF溶液,pH值4.5。釉质表面积与溶液的比率为20mm2/10mL,磁搅拌仪搅拌(100r/min),37℃脱矿72h,形成人工龋。脱矿后用显微硬度计测量釉质表面显微硬度(Knoop压头,载荷10g,保持压力15s),于每个样本釉质开窗区中央垂直测5个点,选择硬度值范围为160~180努氏硬度(Knoophardnessnumber,KHN)

2

釉质块70个,将一侧面积为4mm的开窗面涂布两用于后续显微放射照相分析再矿化层抗酸指甲油,

前的龋损深度和矿物质丢失量,另一侧开窗区用于再矿化循环实验。1.4再矿化pH循环1.4.1

实验分组①NaF组:1g/L的氟化钠溶液,

作为阳性对照;②DDW组:去离子水,作为阴性对

A组:4g/L照;③GCE组:4g/LGCE溶液;④GCE-

1.0mmol/LNaN3溶液、20.0mmol/L4-羟乙基哌嗪

pH值7.0。该循环在37℃环境下进行乙磺酸溶液,

12d,用磁力搅拌器进行搅拌(100r/min)。除了每4次1min的药物处理时间,日2h的脱矿,其余时

间釉质样本则浸泡在再矿化液中。1.5

横断显微放射照相检测pH循环结束后,自凝塑胶包埋釉质样本,贴附

法制备横断显微放射照相(transversemicroradiogra-TMR)的磨片。硬组织切割机从釉质开窗区的phy,

中央锯开样本,切成约300μm厚的牙片,然后流水下磨制成约100μm切片。将制备好的切片包埋,置显微放射X线台照射,照射条件为:20kV,20mA,曝光时间30s。每张切片的矿物丢失量(integratedIML),LP)等结mineralloss,龋损深度(lesiondepth,

果用相应配套的计算机软件TransversalMicroradio-graphysoftware2006(InspektorResearchSystemsBV,荷兰)分析。IML是以深度(μm)为横坐标,矿物含

将这个曲线下的面积积量百分比为纵坐标作曲线,

,其单位为vol%·μm。LP是指从釉质分析时将矿物含量低于正表面到龋损底部的距离,分后获得

常釉质85%的位点定义为龋损。

IML与LP的前后变化值及变化率所采用的公式分别如下:ΔIML=IML2-IML1,矿物丢失量的变化率=ΔIML/IML1×100%;ΔLP=LP2-LP1,龋损深度的变化率=ΔLP/LP1×100%。1.6统计学分析

采用SPSS11.0软件对数据进行统计学分析。组间矿物丢失量、龋损深度变化值选用方差分析和Scheffepost-hoc多重比较检验,P<0.05时差异有统计学意义。2

[10]

GCE-A溶液;⑤GCE-B组:4g/LGCE-B溶液;

C组:4g/LGCE-C溶液;⑦GCE-D组:4g/L⑥GCE-GCE-D溶液。1.4.2

再矿化pH循环每组各10个样本,各实验

溶液pH值调为7.0。采用与前期实验一致的pH循

[3]

环方案,即实验溶液1min→再矿化液1h→实验溶液1min→再矿化液2h→脱矿液2h→再矿化液2h→实验溶液1min→再矿化液1h→实验溶液

1min→再矿化液(至下次循环开始)。pH循环中的脱矿液组分为:2.2mmol/LCa(NO3)2溶液、2.2mmol/LKH2PO4溶液、50.0mmol/L醋酸溶液、1.0mmol/LNaN3溶液,pH值4.5。pH循环中的再矿化液组分为:1.5mmol/LCaC12溶液、0.9mmol/LKH2PO4溶液、130.0mmol/LKCl溶液、

表1

组别NaF组DDW组GCE组GCE-A组GCE-B组GCE-C组GCE-D组注

1)

再矿化pH循环前后各实验组矿物丢失量的变

化如表1所示。

再矿化pH循环前后矿物丢失量

循环后的矿物丢失量

(vol%·μm)2201±3474931±7293028±4504493±5114480±4744714±7464578±562

矿物丢失量的变化值

(vol%·μm)-1319±1381361±356-282±73783±256720±338974±461868±362

(%)-37±5-8±321±521±126±223±7

1)1)

x±s珋

矿物丢失量的变化率

循环前的矿物丢失量

(vol%·μm)

3520±3093570±3733310±5233710±5993660±2653740±4353710±498

38±10

1)

表示该组与其它各组差异均有统计学意义(P<0.05)。

·362·广东牙病防治2013年7月第21卷第7期

pH循环前,各组样本的矿物丢失量基本一致,各组间差异没有统计学意义(P>0.05)。由pH循

DDW组与其余环前后矿物丢失量的变化可以看出,

各组间差异均有统计学意义(P<0.05);NaF组和

GCE组的矿物丢失量较循环前减少,但4g/LGCEA组、作用不如1g/L氟化钠溶液(P<0.05);GCE-GCE-B组、GCE-C组、GCE-D组矿物丢失量的变化率差异没有统计学意义(P>0.05),但均与GCE组差异有统计学意义(P<0.05)。

表2

组别NaF组DDW组GCE组GCE-A组GCE-B组GCE-C组GCE-D组注

1)

再矿化pH循环前后各实验组龋损深度的变化

如表2所示。pH循环前,脱矿液所形成的人工龋损深度基本一致,各组间差异没有统计学意义(P>0.05)。循环前后龋损深度的变化提示,NaF组和GCE组在pH循环后的龋损深度都明显减少,NaF组A、GCE-B、的效果优于GCE组(P<0.05);GCE-GCE-C、GCE-D组的龋损深度都有增加,各组间差异没有统计学意义(P>0.05),但明显小于DDW组(P<0.05)。

x±s珋

龋损深度的变化率(%)

-26±318±3-7±1

10±19±312±211±4

1)1)1)

再矿化pH循环前后龋损深度

循环后的龋损深度(μm)

85±17138±14107±20130±11132±23135±10132±17

龋损深度的变化值(μm)

-30±721±10-10±312±513±315±714±3

循环前的龋损深度(μm)

115±9117±13116±23118±17119±16120±9118±11

表示该组与其它各组差异均有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

天然药物的防龋效能评价需从以下两方面进行:①对口腔微生物的作用;②对牙体硬组织的作用。目前研究较多的天然防龋药物如茶多酚、蜂房、葡萄籽等均有较好的抑菌作用,但在抑制牙体硬组织脱矿及促进再矿化方面却不如五倍子。五倍子是目前研究最多的影响牙体硬组织矿化的天然药物,其活性成分的追踪分析具有重要意义。测量牙体硬组织矿物含量变化最常用的定量指标有TMR检测sectionalmicrohard-和横断显微硬度测试法(cross-CSMH)。CSMH能间接定量测定样本的矿物丢ness,

TMR能够提供更多的参数,失及获得量,与之相比,包括龋损深度、矿物分布、不同深度龋损的矿物含量

[11]

变化等,被誉为定量研究早期龋损的“金标准”,因而本实验选用TMR作为再矿化pH循环前后定量指标。

基于牙齿70%~90%是矿物质且釉质内无细胞与血管的特殊结构,与其它疾病相比,早期龋病不能必须通过物理化学过程通过细胞修复机制而愈合,

(再矿化)才能修复。所谓再矿化是指使用含有钙、磷、氟等无机离子的矿化液作用于脱矿牙体组织,在其表面重新沉淀并结晶化,形成羟基磷灰石或氟磷灰石的过程。牙釉质的再矿化是一个相当复杂的过程,受到多种因素的影响,如唾液或再矿化液中氟、钙、磷离子及其他微量元素的浓度和pH值等。本实

pH循环后,GCE组的龋损深度及矿物验结果发现,

丢失量较循环前减少。与阴性对照组(DDW组)相

GCE4个化学组分皆有一定的促进病损再矿化比,

的作用,但均弱于GCE。由于再矿化液的作用,各实

但循环过程中验组在pH循环后表面矿物含量增加,

每日2h的脱矿过程则使GCE各化学组分组及阴性

[12]

对照组的龋损深度及矿物丢失量较循环前增大。

ten-Cate等[12]发现,pH循环前形成的人工龋损

深度会影响随后的脱矿再矿化平衡。为使基线一致,实验选择脱矿后显微硬度在160~180KHN这一范围的样本进入下一步的再矿化pH循环。本实验人工龋脱矿液脱矿3d后形成的病损深度均值在115~120μm之间,这与相似配方形成的低于100μm的实验结果有一定差异[14]。分析原因可能与样本的选择与制备有关:①在釉质样本的制作过2.5μm碳程中,唇面釉质用抛光机及粒径6.5μm、

抛光,去除表层约120化硅砂纸在流水下依次磨平、

~150μm。但由于牛切牙唇面有一定弧度,为预备

平坦的开窗区,可能去除的表层釉质大于150μm。而牙釉质内的镁、碳酸基团的浓度从表面到釉牙本质界逐渐增加,它们是磷灰石的薄弱组分,容易受酸的侵蚀。故在相同的脱矿条件下,样本表层越接近釉牙本质界,形成的龋损深度越深。②显微放射照相切片的制备。由于显微放射照相是一种破坏性的研究方法,在制备100μm厚度切片的切割、打磨、抛光过程中,常常有样本的破坏,因此真正符合检测要求的样本量并不多。多数文献报道每组样标量约

广东牙病防治2013年7月第21卷第7期

034102.

·363·

4~10[13-15],本实验每组的实验样本量均值为5。因此,样本量偏少可能是另一原因。

脱矿釉质的再矿化是在一个组成与结构复杂且不断变化的环境中进行的,其过程不是单纯的钙盐沉积,还包括钙盐的结晶和晶体的外延生长。关于五倍子促进再矿化的作用机制,现在还不清楚,但普这与其结合钙、磷及蛋白质有关。有研究指遍认为,

2+

Zn2+等离子反出,鞣酸和没食子酸可与蛋白和Ca、

[16-19]

。应形成不可溶性复合物而影响其生物活性

而五倍子含有70%的鞣酸,提示五倍子可能与釉质

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(收稿日期:2013-04-03)

有机质和钙结合形成复合物促进再矿化。另外,五倍子中还含有钙、铁、铬、锰、磷、锶、锌等微量元素,其中钙的含量较高,这些元素均具有参与牙齿再矿化的能力。GCE与钙离子发生反应形成了络合物,通过脱矿后增大的釉质表面孔隙渗入病损区,附着且包绕了部分脱矿的晶体(如碳酸根丧失后的磷灰石),一方面阻止其进一步脱矿,另一方面在已发

形成。生部分溶解的晶体外围诱导新的晶体增长、本实验发现GCE组病损表面及体部皆有明显的矿

4个组分效果不如GCE,推测其促进再物含量增加,

矿化的作用机制可能是各化学组分综合作用的结

果。五倍子促进牙釉质矿化的有效成分还需进一步研究。

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(编辑杨勤)

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