嗅鞘细胞分离培养

嗅鞘细胞分离培养

嗅鞘细胞分离有传统分离法：

1. 显微解剖分离嗅球；

2. 嗅球置于少量ACSF（人工脑脊液）中(4℃冰浴)，在解剖显微镜下，将位于嗅球最外层的嗅神经层、嗅神经及包被的脑膜轻轻剥下，用ACSF洗2次；（用ACSF浸泡组织块，常温放置(室温低于26℃时采用)或4℃放置(室温高于26℃时采用)不超过2h）

3. 组织块用ACSF洗涤两遍：向装有组织块的EP管加入1ml含2*P/S 的ACSF，小心移除ACSF， 再次加入1ml含2*P/S 的ACSF，小心彻底移除ACSF；

4. 加入组织块5倍体积0.125%胰酶(用基础DMEM稀释)，用小剪刀把组织块尽量剪碎，用封口膜封口后，置于37℃水浴锅中, 孵育20min，每隔5 min弹匀一次；

5. 孵育结束后，立即加入1ML完全培养基（DMEM,10%FBS）, 立即混匀，1000g，室温，离心10min，小心移除上清；立即加入0.5 ML完全培养基（DMEM,10%FBS）重悬细胞及组织，吹打12下，把细胞及组织悬液放置于24孔板中，补加培养基至总体积为1.5ml。

分层消化法：

1. 显微解剖分离嗅球；（用ACSF浸泡组织块，常温放置(室温低于26℃时采用)或4℃放置(室温高于26℃时采用)不超过2h）

2. 嗅球用ACSF洗涤两遍：向装有嗅球的EP管加入1ml含2*P/S 的ACSF，小心移除ACSF， 再次加入1ml含2*P/S 的ACSF，小心彻底移除ACSF；

3. 加入组织块5倍体积0.125%胰酶(用基础DMEM稀释)，置于37℃水浴锅中, 孵育15min，每隔5 min弹匀一次，移出含有细胞的酶液，立即加入1ML完全培养基（DMEM,10%FBS）, 立即混匀，1000g，室温，离心10min，小心移除上清；立即加入0.5 ML完全培养基（DMEM,10%FBS）重悬细胞，吹打6下，把细胞悬液放置于24孔板中，补加培养基至总体积为1.5ml。

4. 剩余的嗅球再用酶消化，重复以上操作（第3步）6次，细胞悬液分别收集于6支小试管内备用。

直接挤压法：

1. 显微解剖分离嗅球；（用ACSF浸泡组织块，常温放置(室温低于26℃时采用)或4℃放置(室温高于26℃时采用)不超过2h）

2. 嗅球用ACSF洗涤两遍：向装有嗅球的EP管加入1ml含2*P/S 的ACSF，小心移除ACSF， 再次加入1ml含2*P/S 的ACSF，小心彻底移除ACSF；

3. 嗅球置于2倍体积ACSF中，用眼科镊子直接将嗅球撕烂、挤压，将剩余的片状组织块转移至另一试管内（用镊子移取货离心除上清），用ACSF洗2次（用镊子移取货离心除上清）；

3. 加入组织块5倍体积0.125%胰酶(用基础DMEM稀释)，用小剪刀把组织块尽量剪

碎，用封口膜封口后，置于37℃水浴锅中, 孵育20min，每隔5 min弹匀一次；

4. 孵育结束后，立即加入1ML完全培养基（DMEM,10%FBS）, 立即混匀，1000g，室温，离心10min，小心移除上清；立即加入0.5 ML完全培养基（DMEM,10%FBS）重悬细胞及组织，吹打12下，把细胞及组织悬液放置于24孔板中，补加培养基至总体积为1.5ml。