空肠弯曲菌flhA突变株的构建及其功能研究

第３Ｏ卷第３期　２０１１年５月　食品与生物技术学报　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏ１．３０　ＮＯ．３　Ｍａｙ　２０１１　文章编号：１６７３—１６８９（２０１１）０３—０４５８—０７　空肠弯曲菌ｆｌｈＡ突变株的构建及其功能研究　惠星星，　李烨　王小元　（食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏无锡２１４１２２）　摘　要：ｆｌｈＡ是空肠弯曲茵鞭毛输出装置的关键基因，通过构建Ｃａｒｎｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ　ｆｌｈＡ突　变株ＨＸＷ００１，进行毒力相关表型研究和分析。结果显示ＨＸＷ００１生长性能稳定，但其鞭毛和运　动能力丧失，生物膜形成和自身凝集现象明显下降。Ｒ　ＰＣＲ实验证明ｆｌｈＡ对鞭毛丝主要结构　蛋白基因ｆｌａＡ的表达有一定的调控功能。研究表明ｆｌｈＡ是空肠弯曲菌鞭毛生成和运动能力重　要的分子基础，与空肠弯曲茵致病性密切有关。　关键词：空肠弯曲菌，鞭毛，ｆｌｈＡ，生物膜，自身凝集性　中图分类号：Ｑ　８１２　文献标识码：Ａ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ　ｆｌｈＡ　Ｍｕｔａｎｔ　Ｓｔｒａｉｎ　ＨＵＩ　Ｘｉｎｇ～ｘｉｎｇ，ＬＩ　Ｙｅ　，　ＷＡＮＧ　Ｘｉａｏ—ｙｕａｎ　（Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ　２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ｆｌｈＡ，ｅｎｃｏｄｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｆｌｈＡ，ｉｓ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｌａｇｅｌｌａｒ　ｅｘｐｏｒｔ　ａｐｐａｒａｔｕｓ　ｏｆ　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ．Ｈｅｒｅ　ｗｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎ　ｆｌｈＡ　ｍｕｔａｎｔ　ｓｔｒａｉｎ　ＨＸＷ００１．　Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ，ｔｈｅ＿厂Ｚ　Ａ　ｍｕｔａｎｔ　ｃｅｌｌ　ｃｏｕｌｄ　ｇｒｏｗ　ｗｅｌｌ　ｂｕｔ　ｌａｃｋ　ｆｌａｇｅｌｌａ，ｔｈｅ　ｍｏｔｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｎｔ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｌｏｓｔ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｎｔ　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｏｆｉｌｍ　ａｎｄ　ａｕｔｏａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　ａｌｓｏ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ．　Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｉｔ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｌａｇｅｌｌｉｎ　ｇｅｎｅ　ｆｌａＡ　ｗａｓ　ａｆｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｆｌｈＡ．Ｔｈｅｓｅ　ｆｉｎｄｉｎｇｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｆｌｈＡ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ｆｌａｇｅｌｌａｒ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｍｏｔｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ　ａｎｄ　ｔｈａｔ　ｆｌｈＡ　ｗａｓ　ｃｌｏｓｅｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ，ｆｌａｇｅｌｌａｒ，ｆｌｈＡ，ｂｉｏｆｉｌｍ，ａｕｔｏａｇｇＩｕｔｉｎａｔｉｏｎ　空肠弯曲菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ）是威胁人　氏菌和志贺氏菌感染居首位　卜引。研究和阐明其致　病分子机制有助于对空肠弯曲菌感染的预防和控　制。　类健康常见的食源性病原菌之一，人类感染主要引　起散发性急性胃肠炎，并可导致败血症、关节炎、格　林巴利综合症（Ｇｕｉｌｌａｉｎ－Ｂａｒｒｅ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＧＢＳ）等　并发症。流行病学调查显示，近年来人群中Ｃ．ｊｅ一　端生的鞭毛是空肠弯曲菌细胞表面重要的附　属结构，大量研究已经表明，鞭毛不仅是空肠弯曲　菌运动器官，而且在免疫、趋化、定植、侵入、毒力蛋　．，　２　感染率呈逐年上升的趋势，有时甚至超过沙门　收稿日期：２０１０－０５—１６　基金项目：食品科学与技术国家重点实验室自由探索课题项目（ｓＫＬＦ＿Ｔ　２ＯＯ８Ｏ７），江苏省创新学者攀登计划项目　（ＢＫ２００９００３）。　＊通信作者：李烨（１９６４一），女，江苏淮安人，副教授，主要从事食源性病原微生物研究。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｙｅ３８６＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ　第３期　惠星星等：空肠弯曲菌ｆｌｈＡ突变株的构建及其功能研究４５９　白分泌等许多方面表现出致病相关性［３　］。鞭毛的　布的Ｃ．　ｕｎｉ　ＮＣＴＣｌ１１６８菌株的序列设计ｆｌｈＡ　结构及其介导的运动是鞭毛致病相关性表现的基　的引物，通过ＰＣＲ扩增反应，从Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ　础，Ｃ．　ｕｎｉ完整的鞭毛由鞭毛丝、鞭毛钩、基体及　ＡＴＣＣ３３２９１上扩增出ｆｌｈＡ，其全长为２　１７５ｂｐ。　其基部的鞭毛输出系统组成，Ｃ．ｊｅ）ｕｎｉ鞭毛的合　引物分别为Ｆ１：ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ，５＂－ＣＧＡＴＴ—　成、装配和表面修饰是一个有序而级联的过程，相　ＴＡＧＴＴＴＴＴＣＣＴＴＴＣＴＴＧＧ一３　，Ｒ　１：　ｒｅｖｅｒｓｅ　关基因以鞭毛装配的顺序依次表达，鞭毛输出系统　ｐｒｉｍｅｒ，５　ＧＴＴＣＴＡＴＣＣＴＡＡＴＡＡＴＡＣＣＣＴＣＧ一３　相关基因是该过程早期表达的基因，有研究显示对　；ＰＣＲ反应体系为５Ｏ　Ｌ，使用的是ＥＸ　Ｔａｇ酶，扩　鞭毛基因有序表达有调控功能［７］，但具体的分子机　增产物末端自动加上Ａ。ＰＣＲ扩增条件为：９４℃　制仍不是很清楚。分析已公布的基因组信息，Ｃ．　预变性５　ｍｉｎ，９４℃变性３０　Ｓ，５５℃退火３０　Ｓ，７２℃　ｊｅｊｕｎｉ基因组中缺乏大肠杆菌、耶尔森氏菌等具有　延伸２．５　ｒａｉｎ，３５个循环，７２℃再延伸１０　ｍｉｎ，１０　的鞭毛主调控基因ｆｌｈＤＣ，且缺乏编码专门的Ⅲ分　。Ｃ保存。　泌系统（ＴＴＳＳ）的基因，大部分研究认为细菌Ⅲ型　从ＰＥＴ２８ａ质粒上扩增ｋａｎ　抗性基因盒，引物　毒力蛋白分泌系统与鞭毛输出系统在进化上是同　分别为Ｆ２：ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ，５，＿ＣＡＴＧ　ＣＣＡ］　Ｇ　ＣＴＴＴ—　源的，且有研究表明Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ能通过鞭毛输出Ⅲ　ＧＡＴＣＴＴＴＴＣ　ＣＧＧＧＧＴＣ一３　，Ｒ２：ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ，５　型毒力蛋白［８］。基于对以上研究的分析，我们认为　－，ＣＡｒＧ　ＣＣＡ啪ＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＴＴＴＴＣＧＧＧＧ一３　，　鞭毛输出系统可能是Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ鞭毛致病相关性重　其中下划线表示Ｎｃｏ工酶切位点。ＰＣＲ反应体系　要的分子基础。　为５０　Ｌ，扩增条件为：９４℃预变性５　ｍｉｎ，９４℃变　本文主要运用分子生物学手段，通过构建相关　性３０　Ｓ，５５℃退火３０　ｓ，７２℃延伸１．５　ｍｉｎ，３５个循　基因突变株并进行毒力相关表型研究和分析，揭示　环，７２℃再延伸１０　ｒａｉｎ，１０℃保存。　Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ鞭毛输出系统关键基因ｆＺｈＡ的功能。　１．２．２　重组敲除质粒的构建和测序　将从　１材料与方法　Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ　ＡＴＣＣ３３２９１基因组上克隆到的ｆｌｈＡ在　Ｔ４　ＤＮＡ连接酶的作用下连接到ＰＭＤ－１９Ｔ载体　１．１　材料　上。将连接混合物用ＣａＣ１。法转人Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭｌＯ９　１．１．１　菌株和质粒Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ　ＡＴＣＣ３３２９１购买　中，筛选阳性克隆并进行酶切验证。将重组质粒和　于美国标准生物品收藏中心（ＡＴＣＣ），大肠杆菌　ｋａｎ　抗性基因盒分别用Ｎｃｏ　Ｉ消化，消化产物酶连　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９和质粒ＰＥＴ２８ａ均由本实　后转化人Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９中，挑取阳性克隆菌株提取　验室保藏，质粒ＰＭＤ－１９Ｔ购买于ＴａｋａＲａ公司。　重组敲除质粒，进行酶切验证，并委托上海生物工　１．１．２培养基　程公司测定插入片段的核苷酸序列（见图１）。Ｎｃｏ　１）Ｅ．ｃｏｌｉ：ＬＢ液体、固体培养基；２）Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ：　工是ｆｌｈＡ内部的一个单切点，两侧同源臂分别为　ＭＨ（ＢＤ）液体、固体培养基。　７００　ｂｐ和１　４００　ｂｐ左右，ＰＭＤ－１９Ｔ和ｋａｎ　内部无　１．２方法　此酶切位点。　１．２．１　引物设计和片段扩增　根据ＮＣＢＩ上已公　图１重组质粒ＰＭＤ－１９Ｔ－ｆｌｈＡ－ｋａｎ　的构建　Ｆｉｇ．１　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＰＭＤ－１９Ｔ－ｆｌｈＡ－ｋａｎ　１．２．３　ｆｌｈＡ突变株的构建　采用电击法将构建　夜培养的菌株，用ＥＰＢ（２７２　ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖、１５　甘　好的敲除载体转化入Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ　ＡＴＣＣ３３２９１中，主　油、２．４３　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｋ２　ＨＰｏ４、０．５７　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＨ２　要参考Ｍｉｌｌｅｒ等　的方法稍作修改：收集平板上过　ＰＯ　，ｐＨ　７．４）悬浮，吹打混匀，ＤＮＡ与菌液混合置　４６０　食　品　与　生　物　技　术　学　报　第３Ｏ卷　于冰上１０　ｒａｉｎ（菌液１００　Ｌ，ＤＮＡ６００　ｎｇ），电击６　待培养到指定时间，吸走培养基，将９６孔板置于５５　ｋＶ／ｃｍ，５　ｍｓ，置于冰上１０　ｒａｉｎ，将菌液涂布于ＭＨ　℃干燥３０　ｒａｉｎ，加入１　ｍＬ　０．１　的结晶紫室温下染　平板上３７℃恢复，收集菌体，涂布于含ｋａｎ的ＭＨ　色５　ｒａｉｎ，将未吸附的结晶紫吸走，用ｄｄＨ　Ｏ洗两　平板上筛选，挑取转化子，ＰＣＲ验证双交换同源重　遍，将９６孔板置于５５℃干燥１５　ｒａｉｎ，用体积分数　组产物。　８０　乙醇一２０　丙酮洗脱吸附的结晶紫，吸取１００　１．２．４　测定生长曲线　通过分别测定Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ　Ｌ洗脱液置于９６孔板中，使用酶标仪测量其在　ＡＴＣＣ３３２９１和ＨＸＷＯ０１的生长曲线，观察菌株突　５７０　ｎｍ下的吸光度，比较Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ　ＡＴＣＣ３３２９１和　变前后在液体培养基中生长规律的变化。将过夜　ＨＸＷＯＯ１生物膜形成能力的差异。　培养的Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ　ＡＴＣＣ３３２９１及ＨＸＷＯ０１转接到　１．２．８　自身凝集性（ａｕｔ０ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ，ＡＡＧ）　研　５Ｏ　ｍＬ　ＭＨ培养液中，使初始ＯＤ　。。为０．０２，于　究主要根据Ｌｉｅｋｅ　Ｂ．ｖｏ．ｒｌ　Ａｌｐｈｅｎ等　方法稍加修　３７℃，２００　ｒ／ｒａｉｎ摇床培养。从转接开始，每隔２　ｈ　改，将Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ　ＡＴＣＣ３３２９１和Ｈｘｗ００１在ＭＨ　测定ＯＤ。　直至生长稳定期，空白对照用ＭＨ培养　液体培养基中培养至对数期，收集到灭菌的ＰＢＳ　液，并保证测定ＯＤ。。。在０．２～０．８内。根据实际　（ｐＨ为７．５）缓冲液中，ＯＤ。∞调整到１．０，吸取４　ｍＬ　ＯＤ　。。一测定ＯＤ　。。值×稀释倍数×２（比色杯光程　菌液置于灭菌的试管中，室温静置，每隔１　ｈ拍照，　为０．５　ｃｍ），计算实际菌浓，绘制细菌生长曲线图。　从上清液的上部吸取１　ｍＬ菌液，混匀，测定其在　１．２．５　透射电镜观察　使用透射电镜观察　６００　ｒｉｍ下的吸光度，每样做３个平行。自身凝集性　Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ　ＡＴＣＣ３３２９１及ＨＸＷ００１的菌体形态，菌　强的菌株将不会保留在上清液的上部，从而导致上　体划线过夜培养，体积分数２．５　的戊二醛固定，１　部的ＯＤ值降低，根据不同时间测定的ＯＤ值绘图，　ｇ／ｄＬ磷钨酸染色，透射电镜（Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｈ～７０００，Ｊａ—　观察野生型和突变株形成ＡＡＧ能力的差异。　ｐａｎ）观察。　１．２．９　ＲＴ—ＰＣＲ的方法研究ｆｌｈＡ的调节功能　１．２．６　运动能力实验　参考Ｋａｌｍｏｋｏｆｆ等口。。的方　本实验主要利用ＲＴ—ＰＣＲ技术研究　＾Ａ对鞭毛　法稍加修改：各吸取１肚Ｌ活化后菌液（ＯＤ　为　丝主结构蛋白合成基因ｆｌａＡ和调节因子合成基因　０．５）穿刺接种到０．４　ｇ／ｄＬ的琼脂平板中，置于烛缸　ｆｌｉＡ（ｄ　）、ｒｐｏＮ（ｄ　）在转录水平上的调节作用。　中３７。Ｃ培养２　ｄ后，观察Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ　ＡＴＣＣ３３２９１和　选择１６ｓｒＤＮＡ为内参基因，相关基因的扩增引物　ＨＸＷ００１从接种点向四周运动扩散的生长情况。　如表１所示。用ＲＮＡ提取试剂盒提取ｗＴ和　１．２．７生物膜形成能力　根据Ｒｅｅｓｅｒ等　的方　ＨＸＷ００１的总ＲＮＡ，定量，保持两者一致；使用　法稍作修改，分别测定Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ　ＡＴＣＣ３３２９１和　ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ试剂盒去除ＲＮＡ中的ＤＮＡ，　ＨＸＷ００１的生物膜形成能力。将Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ　排除ＤＮＡ污染；按照ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ　ＭＦｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤ—　ＡＴＣＣ３３２９１和ＨＸＷ００１在ＭＨ液体培养基中培　ＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ操作步骤合成ｃＤＮＡ，使用设计　养至对数期，以初始ＯＤ。。。为０．０２５接种到含有１　的各基因的ＲＴ—ＰＣＲ引物进行ＰＣＲ扩增，扩增条　ｍＬ　ＭＨ液体培养基９６孔板（聚苯乙烯）中，每样３　件为：９４℃预变性５　ｒａｉｎ，９４℃变性３０　Ｓ，５５℃退火　个平行，盖上封膜，置于玻璃干燥器中，３７℃培养，　３０　Ｓ，７２℃延伸２Ｏ　Ｓ，２０个循环，７２℃再延伸１０　ｒａｉｎ，　分别测定其在２４、４８、７２ｈ，形成生物膜膜的能力。　１０℃保存。１　ｇ／ｄＩ　琼脂糖凝胶电泳进行检测。　表１本研究中所使用的ＲＴ－ＰＣＲ引物　Ｔａｂ．１　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　引物　寡核苷酸序列　ｆ／ａＡ　ＲＴＦ　５　一ＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＡＣＣＡＡＴＧ一３　ｆｌａＡ　ＲＴＲ　５　一ＣＡＴＴＡＣＣＡＴＴＡＧＡＴＡＴＡＧＣＴＴＧＡＣＣ一３　ｆｔｉＡ　ＲＴＦ　５　一ＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＧＡＡＡＧＡＣＧＡＡＧ一３　ｆＺｉＡ　ＲＴＲ　５　一ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＡＣＧＣＣＴＡＴＧ一３　ｒｐｏＮ　ＲＴＦ　５　一ＧＧＡＧＴＴＡＧＡＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＡＴＧ～３　ｒｐｏＮ　ＲＴＲ　５　一ＧＧＡＴＴＧＡＡＡＴＴＴＣＡＧＧＡＴＡＡＴＡＡＴＣ一３　１６ｓｒＤＮＡ　ＲＴＦ　５　一ＧＴＣＧＡＡＣＧＡＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧ一３　ｌ６　ｒＤＮＡ　ＲＴＲ　５　一ＣＴＡＴＡＴＡＧＴＣＴＣＡＴＣＣＴＡＣＡＣＣＧ一３　第３期　惠星星等：空肠弯曲菌ｆｌｈＡ突变株的构建及其功能研究４６１　２　结　果　２．１　成功构建ｃ　ｊｅｊｕｎｉ　ＡＴＣＣ３３２９１　ｆｌｈＡ突变株　分别以Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ　ＡＴＣＣ３３２９１基因组和　ＰＥＴ２８ａ质粒为模板，分别用引物Ｆ１／Ｒ１，Ｆ２／Ｒ２扩　增出ｆｌｈＡ（２　１７５　ｂｐ）和ｋａｎ　（１　０３２　ｂｐ），经１　ｇ／ｄＬ　琼脂糖凝胶电泳检测，泳道１中在２　０００和２　５００　ｂｐ之间有一条明显的亮带即为目的条带，泳道３中　在１　０００和１　５００之间有目的条带。将从Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９中提取出来的重组质粒ＰＭＤ－１９Ｔ一．　Ａ和　ＰＭＤ－１９Ｔ－ｆｌｈＡ－ｋａｎ　ｒ用ＮＣＯ工酶切验证，１　ｇ／ｄＬ　琼脂糖凝胶电泳检测，泳道２在３　０００和３　５００　ｂｐ　之间有单一条带，单酶切大小正确，说明－厂ｚ　Ａ基因　顺利连接到ＰＭＤ－１９Ｔ载体上；泳道４中在ｌ　０００　ｂｐ左右和３　０００到３　５００　ｂｐ之间各有一条条带，单　酶双切大小正确，说明ｋａｎ　抗性基因顺利插入到　ＰＭＤ－１９Ｔ—ｆｌｈＡ基因中间，重组质粒构建成功。如　图（２—１）所示，同时，重组质粒测序结果显示正确。　分别提取Ｃ．　ｕｎｉ　ＡＴＣＣ３３２９１和ｆｌｈＡ敲除　转化子的基因组，以其为模板，使用引物Ｆｌ／Ｒ１进　行ＰＣＲ扩增验证ｆｌｈＡ是否已被ｋａｎ　定点插入，　从图２—２中可以看出泳道１作为对照在２　０００至　２　５００之间有一条带，泳道２在３　０００至３　５００之间　有一条带，即为，ｚ＾Ａ—ｋａｎ　的大小，大小完全正确，　证明ｆｌｈＡ突变株构建成功，并命名为ＨＸＷ００１。　Ｍ　１　２　３　４　５　２　１　Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ　ｌ：ＰＣＲ扩增ｆｌｈＡ；２：Ｎｃｏ　Ｉ酶切ＰＭＤ－１９Ｔ－ｆｌｈＡ；　３：ＰＣＲ扩增ｋａｎ　；４：ＮｃｏＩ酶切ＰＭＤ－１９Ｔ～ｆｌｈＡ—ｋａｎ　图２－１重组质粒的构建　Ｆｉｇ．２－１　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　２．２　ＨＸＷ００１在液体环境中生长稳定　通过测定生长曲线，比较Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ　ＡＴＣＣ３３２９１与ＨＸＷｏ０１液体环境中生长情况的　差异，结果如图３所示，Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ　ＡＴＣＣ３３２９１和　ＨＸｗＯＯ１在各个时期的生长状况几乎完全相同。　３　２　Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；１：野生型对照；２：以突变株基因组为模板ＰＣＲ　扩增ｆｍ　图２—２　ｆｌｈＡ突变株构建　Ｆｉｇ．２－２　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｌｈＡ　ｍｕｔａｎｔ　Ｏ．９　０．８　Ｏ．７　Ｏ．６　０．５　０　０．４　０．３　Ｏ．２　Ｏ．１　Ｏ　０　５　１０　ｌ　５　２Ｕ　２５　ｔ／ｈ　图３　Ｃｊｅｊｕｎｉ　ＡＴＣＣ３３２９１　ｗＴ和ＨＸＷ００１生长曲线　的测定　Ｆｉｇ．３　Ｇｒｏｗｔｈ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　Ｃ　ｊｅｊｕｎｉ　ＡＴＣＣ３３２９１　ａｎｄ　ＨＸＷ００１　２．３　ＨＸＷ００１丧失运动能力　在０．４　ｇ／ｄＬ的半固体琼脂平板上测定　Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ　ＡＴＣＣ３３２９１和ＨＸＷ００１的运动能力，如　图４所示，在培养２　ｄ后，Ｃ．　ｕｎｉ　ＡＴＣＣ３３２９１形　成明显的扩散生长环，而ＨＸＷ００１只在接种处生　长，丧失了运动能力。　图４在０．４　ｇ／ｄＬ半固体琼脂平板上测运动能力　Ｆｉｇ．４　Ｍｏｔｉｌｉｔｙ　ｔｅｓｔ　ｏｎ　０．４　ｇ／ｄＬ　ｓｅｍｉ－ｓｏｌｉｄ　ａｇａｒ　ｐｌａｔｅ　２．４　电镜观察ＨＸＷ００１失去鞭毛　比较透射电镜的观察结果（见图５），ＨＸＷ００１　虽形态仍为螺旋，但丧失了鞭毛结构，这与上述运　第３期　惠星星等：空肠弯曲菌ｆｚｈＡ突变株的构建及其功能研究４６３　上探索空肠弯曲菌的致病机制，但迄今尚不完全清　楚。生物信息学分析表明，较其它几种常见的肠道　致病菌，Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ鞭毛输出系统可能与鞭毛有更为　紧密的致病相关性。革兰氏阴性肠道病原菌鞭毛　输出系统主要由　Ａ、ＦｌｈＢ、Ｆｌｉ０、ＦｌｉＰ、ＦｌｉＱ、　ＦｌｉＲ、ＦｌｉＩ、ＦｌｉＦ、Ｆｌｉｒｔ　９种蛋白构成，其中ｆｌｈＡ是　鞭毛输出装置中的关键组分［】引。　基于基因同源重组的原理，运用分子生物学技　术，本研究成功构建了Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ　ｆｌｈＡ插入失活突　变株ＨＸＷ００１。生长曲线测定显示，ＨＸＷ００１和　ｗＴ的生长状况几乎完全相同，电镜观察可见其基　本形态没有变化，说明ｆｌｈＡ并不是Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ菌株　生长所必须的基因，这也为后期进行的一系列实验　排除了由于生长状况而造成的差异。电镜观察和　运动性分析表明，ＨＸＷ００１丧失了鞭毛以及运动　能力，可见．　＾Ａ是鞭毛生成所必需，与Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ　的运动性具有密切的关系。运动能力是空肠弯曲　菌一个非常重要的毒力因素，在感染的起始阶段赋　予菌体趋化能力，并可促进细菌对宿主细胞的黏附　和侵入，运动能力的丧失将严重影响空肠弯曲菌在　肠道的定植，导致致病性下降。　空肠弯曲菌个体对环境要求非常苛刻，对氧气　浓度非常敏感，其之所以能够在食品上及污水中生　存从而造成人类疾病，主要是因为能够形成抵抗外　界不利的环境的生物膜。生物膜研究创始人之一　的ＣｏｓｔｅｒｔｏｎＥＨ　在１９９５年将生物膜定义为由细菌　分泌的胞外基质包裹着菌体在有生命的或无生命　的物体表面形成的高度组织化的多细胞结构。当　细菌受到各种压力，如低ｐＨ值，高渗透压，抗菌剂　和抗生素等，为了抵抗不利的环境，细菌便以同样　的方式生长形成生物膜，这是细菌具有的一种非常　重要的环境适应机制。在Ｃ．ｊｅ）ｕｎｉ其它菌株的研　究中已经显示，鞭毛结构对生物膜初期、成熟有重　要作用Ｉ１　。本实验研究发现Ｃ．ｊｅ）ｕｎｉ　ｆｌｈＡ缺失　导致了生物膜形成能力严重下降，推测主要可能是　因为鞭毛的缺失的影响。鞭毛介导的运动性能促　进菌体对物体表面的附着，在生物膜的形成过程　中，可能需要鞭毛作为菌体间的识别因子，另推测　可能由于在形成生物膜的过程中需要鞭毛输出装　置输出生物膜形成过程中所必须的因子，而ｆｌｈＡ　作为鞭毛输出装置中的关键基因，其丧失必然会影　响到生物膜的形成。　自身凝集性（ＡＡＧ）是许多Ｇ一病原菌的毒力标　志，在　Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、ｅ　￡Ｐｒ０　ｎ￡　０ｇＰ　ｃ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ和Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａ致病机制中起着　重要的作用［１　。目前，已有研究表明Ｃ．ｊｅ）ｕｎｉ　不同菌种形成ＡＡＧ的能力差异很大，主要分为３　种类型：（ｉ）ＡＡＧ形成能力非常强；（ｉｉ）形成ＡＡＧ　能力弱，水洗后，形成能力增强，（ｉｉｉ）形成ＡＡＧ能　力非常弱，水洗没有任何影响［１　。通过本次研究，　我们发现Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ　ＡＴＣＣ３３２９１属于第一类，具有　非常强的自身凝集现象，ＡＡＧ的形成对空肠弯曲　菌侵入宿主细胞起着非常重要的作用，而ｆｌｈＡ的　缺失，使得ＡＡＧ形成能力严重减弱，导致空肠弯曲　菌致病性严重下降。　Ａ的缺失，影响了鞭毛蛋白　的合成和装配，而鞭毛丝上的糖基化蛋白很可能是　自体凝集的重要因子。　Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ鞭毛的合成、装配和表面修饰是一个　有序而级联的过程，存在三级调控系统，分别受ｏ　、　ｏ弘、ａ。。调节。ｄ　。（ｆｌｉＡ）主要调节鞭毛丝（ｆｌａＡ）蛋　白、帽蛋白、鞭毛蛋白翻译后修饰蛋白以及毒力蛋　白的合成，ｄ　（ｒｐｏＮ）主要调节鞭毛钩、基体、鞭毛丝　（ｆｌａＢ）及其他相关功能未知蛋白的合成，ｆｌｈＡ受　ａ　。调节，是三级调控系统中早期表达的基因，对鞭　毛后期基因的有序表达有调控功能＿７］，但具体的分　子机制仍不是很清楚。本文通过ＲＴ—ＰＣＲ技术研　究初步显示，ｆｌｈＡ对于鞭毛丝主结构蛋白合成基　因ｆｌａＡ有重要的调控作用，　Ａ丧失，使得ｆｌａＡ　在转录水平上的合成大大减少，从而影响鞭毛丝蛋　白的合成，这可能是菌体本身的自我调节作用，　ｆｌｈＡ为鞭毛输出装置的关键基因，其影响合成鞭　毛丝蛋白的输出，菌体为了节省能量，在ｆｌｈＡ丧失　时，直接降低鞭毛丝蛋白在转录水平上的表达。但　是ｆｌｈＡ功能缺失的信号通过何种分子传导途径影　响．∥口Ａ的表达，是值得深入探索的研究课题，本文　研究结果初步显示　＾Ａ功能缺失，在降低ｆｌａＡ转　录的同时并没有明显影响ｆｌａＡ的直接调节因子　。鹞的表达，也没有明显影响ａ船上级调节因子ａ　的　表达，是否Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ　ｆｌｈＡ是通过强化ｄ　。抗性因子　ＦｌｇＭ途径调控ｆＺａＡ的表达，还是通过其他途径　等，是令人感兴趣的问题，也是本课题拟进一步深　入研究的内容之一。　４　结　语　本文的研究结果表明，Ｃ．　ｕｎｉ鞭毛输出系统　的关键基因ｆｌｈＡ对鞭毛的合成和装配起重要作　用，是鞭毛结构和功能的分子基础。本研究构建的　ｆ／ｈＡ插入失活突变株ＨＸＷ００１生长性能稳定，运　动能力丧失，生物膜形成能力和自身凝集现象明显　下降，表明该变异株毒力明显减弱，有望成为减毒　４６４　活菌疫苗的候选菌株。　食　品　与　生　物　技术　学　报　第３Ｏ卷　参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）：　［１］Ａｌｔｅｋｒｕｓｅ　Ｓ　Ｆ，Ｓｔｅｒｎ　Ｎ　Ｊ，Ｆｉｅｌｄｓ　Ｐ　Ｉ，ｅｔ　ａ１．Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ　ａｎ　ｅｍｅｒｇｉｎｇ　ｆｏｏｄ　ｂｏｒｎｅ　ｐａｔｈｏｌｏｇｅｎ［Ｊ］．Ｅｍｅｒｇ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ，１９９９，５：２８—３５．　］Ｒｙａｎ　Ｍ　Ｍ．Ｇｕｉｌｌａｉｎ—Ｂａｒｒｅ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｉｎ　ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ［Ｊ］．Ｊ　Ｐａｅｄｉａｔｅｒ　Ｃｈｉｌｄ　Ｈｅａｌｔｈ，２Ｏ一０５，４１：２３７—２４．　［２　［３　］Ｗａｓｓｅｎａａｒ　Ｔ　Ｍ，Ｂｌｅｕｍｉｎｋ—Ｐｌｕｙｍ　Ｎ　Ｍ，ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｚｅｉｊｓｔ　Ｂ　Ａ．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｍｐｙｌ－ｏｂａｃｔｅｒ　ｕｎｉ　ｆｌａｇｅｌｌｉｎ　ｇｅｎｅｓ　ｂｙ　ｈｏ　ｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ　ｔｈａｔ　ｆｌａＡ　ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｆｌａＢ　ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｉｎｖａｓｉｏｎ［Ｊ］．ＥＭＢＯ　Ｊ，１９９１，１０：２０５５—　２Ｏ６１．　［４］Ｇｒａｎｔ　Ｃ　Ｃ，Ｋｏｎｋｅｌ　Ｍ　Ｅ，Ｃｉｅｐｌａｋ　Ｊｒ　Ｗ，ｅｔ　ａ１．Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｆｌａｇｅｌｌａｒ　ｉｎ　ａｄｈｅｒｅｎｃｅ，ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｍｐｙ—　ｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ　ｉｎ　ｎｏｎｐｏｌａｒｉｚｅｄ　ａｎｄ　ｐｏｌ～ａｒｉｚｅｄ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ，１９９３，６１：１７６４—１７７１．　［５］Ｙａｏ　Ｒ，Ｂｕｒｒ　Ｄ　Ｈ，Ｄｏｉｇ　Ｐ，Ｔｒｕｓｔ　Ｔ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｔｉｌｅ　ａｎｄ　ｎｏｎ－ｍｏｔｉｌｅ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｏｆ　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅ—　ｊｕｎｉ：ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｍｏｔｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ａｄｈｅｒｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ｏｆ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｍｏ１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９４，１４：８８３—８９３．　［６］Ｌｅｅ　Ａ，ＯＲｏｕｒｋｅ　Ｊ　Ｌ，Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ　Ｐ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｍｕｃｕｓ　ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ａｓ　ａ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ　ｏｆ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｉｎ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ：ａ　ｍｏｕｓｅ　ｃｅｃａｌ　ｍ－ｏｄｄ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ，１９８６，５１：５３６—５４６．　［７］Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ　Ｄ　Ｃａｒｒｉｌｌｏ，Ｅｄｕａｒｄｏ　Ｔａｂｏａｄａ，Ｊｏｈｎ　ＨＥ　Ｎａｓｈ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ　ｅｘｐｒ－ｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｅｓ　ｏｆ　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　—　ｕｎｉ　ＮＣＴＣ１１１６８　ｒｅｖｅａｌｓ　ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｔｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｂｙ　ｌｆｈＡ［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２０—０４，２７９：２０３２７—２０３３８．　［８］Ｋｏｎｋｅｌ　Ｍ　Ｅ，Ｋｌｅｎａ　Ｊ　Ｄ，Ｒｉｖｅｒａ－Ａｍｉｌｌ　Ｖ，ｅｔ　ａ１．Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ　ｉｓ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｏｎ　ａ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｆｌａｇｅｌｌａｒ　ｅｘｐｏｒｔ　ａｐｐａｒａｔｕｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，２００４，１８６：３２９６—３３０３．　［９］Ｊｅｆｆ　Ｆ　Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｊ　Ｄｏｗｅｒ，Ｌｕｃｙ　Ｓ　Ｔｏｍｐｋｉｎｓ．Ｈｉｇｈ－ｖｏｌｔａｇｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ　ｗｉｔｈ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ［Ｊ］．Ｐｒｏｅ　Ｎａｔｉ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，１９８８，８５：８５６—８６０．　［１Ｏ］Ｍａｒｔｉｎ　Ｋａｌｍｏｋｏｆｆ，Ｐａｔｒｉｃｉａ　Ｌａｎｔｈｉｅｒ，Ｔａｍｍｙ－Ｌｙｎｎ　Ｔｒｅｍｂｌａｙ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ　１１１６８　ｂｉｏｆｉｌｍｓ　ｒｅｖｅａｌｓ　ａ　ｒｏｌｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｍｏｔｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｉｎ　ｂｉｏｆｉｌｍ　Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｉ，２００６，１８８：４３１２—４３２０．　［１１］Ｒｙａｎ　Ｊ　Ｒｅｓｓｅｒ，Ｒｏｂｅｒｔ　Ｔ　Ｍｅｄｌｅｒ，Ｓｔｅｐｈｅｎ　Ｊ　Ｂｉｌｌｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ　ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ　ｂｉｏｆｉｌｍｓ　ｕｎｄｅｒ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，７３：１９Ｏ８—１９１３．　［１　２］Ｌｉｅｋｅ　Ｂ　ｖａｎ　Ａｌｐｈｅｎ，Ｍａｎｆｒｅｄ　Ｗｕｈｒｅｒ，Ｎａｎｃｙ　ＭＣ　Ｂｌｅｕｍｉｎｋ—Ｐｌｕｙｍ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊ　ｕｎｉ　ｍａｆ４　ｇｅｎｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎ　ｎｏｖｅｌ　ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ　ｏｎ　ｆｌａｇｅｌｌｉｎ　ａｎｄ　ａｌｔｅｒｅｄ　ａｕｔｏａｇｇ１ｕｔｉｎａｔｉ０ｎ　ｂｅｈａｖｉｏｒ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，１５４：３３８５—３３９７．　［１３］Ｒｏｂｅｒｔ　Ｍ　Ｍａｃｎａｂ．ＴｙｐｅｌｌＩｆｌａｇｅｌｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｏｒｔ　ａｎｄ　ｆｌａｇｅｌｌａｒ　ａｓｓｅｍｂｌｙ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ，２００４，１６９４：　２０７　２１７．　［１４］Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ　Ｊ　Ｗ，Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋｉ　Ｚ，Ｃａｌｄｗｅｌｌ　ＤＥ，ｅｔ　ａ１．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｂｉｏｆｉｌｍｓ［Ｊ］．Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ，１９９５，１４９：７１１—７４５．　［１５］０’Ｔｏｏｌｅ　Ｇ．Ａ　ａｎｄ　Ｒ　Ｋｏｌｔｅｒ．Ｆｌａｇｅｌｌａｒ　ａｎｄ　ｔｗｉｔｃｈｉｎｇ　ｍｏｔｉｌｉｔｙ　ａｒｅ　ｎｅｃｅｓｓａｒｙ　ｆｏｒ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ｂｉｏｆｉｌｍ　ｄｅｖｅｌｏｐ—　ｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｍｏ１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｉ，１９９８，３０：２９５—３０４．　［１　６］Ｃｈｉａｎｇ　Ｓ　Ｌ，Ｔａｙｌｏｒ　Ｒ　Ｋ，Ｋｏｏｍｅｙ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｓｉｎｇｌｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｎ—ｔｅｒｍｉｎｕｓ　ｏｆ　Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ　ＴｃｐＡ　ａｆｆｅｃｔ　ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ，ａｕｔｏａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｓ—ｅｒｕｍ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．Ｍｏ１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９５，１７：１１３１—１１４２．　［１７］Ｋｎｕｔｔｏｎ　Ｓ，Ｓｈａｗ　Ｒ　Ｋ，Ａｎａｎｔｈａ　Ｒ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｔｙｐｅＩＶ　ｂｕｎｄｌｅ—ｆｏｒｍｉｎｇ　ｐｉｌｕｓ　ｏｆ　ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｕｎｄｅｒ—　ｇｏｅｓ　ｄｒａｍａｔｉｃ　ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｄｈｅｒｅｎｃｅ，ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｓｐｅｒｓａｌ［Ｊ］．Ｍｏ１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，　１９９９，３１：４９９—５０９．　［１８］Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐ　Ａ，Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ　Ｈ　Ｒ，Ｆｌｕｇｅｌ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｉｎ　ＹａｄＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎ—　ｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ　ａｂｒｏｇａｔｅｓ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ，ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｒｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｍｏｕｓｅ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．Ｍｏｌ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９５，１６：１２０７—１２１９．　［１９１　Ｍｉｓａｗａ　Ｎ，Ｂｌａｓｅｒ　Ｍ　Ｊ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｕｔｏａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｂｙ　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ。２０００。６８：６１６８—６１７５．