EGFR 基因突变（ARMS 法）检测标准操作规范
1、 目的：明确 EGFR 基因突变（ ARMS 法）检测操作、结果判断、报告内容及质控
管理规程，保证检测结果的靠谱性。 2、 履行人：李文辉、郭志云
3、 试剂本源 ：苏州为真生物医药科技有限公司 4、 质控物：阴性、阳性比较均为试剂配套。 5、 实验操作步骤 ： 提取
FFEP 样本 DNA 的提取 (QIAGEN)
（1）切片、烤片：切 3~5 张厚度为 8~10μm 的组织片， 捞至一般玻片上（若为小组织，
则切 10 张，同一玻片可捞多张） ，60℃考片 30 分钟；大组织别的切一张 3μm 组织片进行惯例 HE 染色，作病理评估之用。
（2）脱蜡： 将组织切片置于二甲苯中室温脱蜡 2 次，每次 10min；随后浸入 100%乙
醇 3min。将组织切片挨次室温置于 100%、 80%、70%梯度乙醇中各 2min，复水后，室温浸入去离子水 3min。
（3）评估、刮片： 组织片经病理评估后，用干净盖玻片刮取癌组织密集地域，并转移
至干净的管中；小组织所有刮取至管中。
（4）消化：加入 180μlATL 和 20μl 蛋白酶 K ，震荡混匀，依据组织大小可增添消化
液的用量， 56℃， 1h，依据组织大小可延长消化时间甚至过夜消化（时期可以合适摇晃颠倒样品，使之混匀裂解充分；可裂解至组织消化完）。
（5）升温： 将温度调至 90℃，作用 1h（注意管盖， 90℃高温可能会以致爆盖以致液体
被蒸发；时间不要太长 1 小时足够；一个水浴锅时， 56℃到 90℃之间过渡时应将样本置于室温中，待温度完整升到 90℃后再将样本放进去）。
（6）短暂离心使液体聚于管底，加入 200μlAL ，震荡混匀，而后加入 200μl 无水乙醇，
震荡混匀。
（7）短暂离心使液体聚于管底，将整个液体所有移入采集柱中，而后
1min，抛弃采集管后将采集柱至于新的采集管中。
（8）加入 500μlAW1漂洗液，离心 8000rpm，1min，抛弃采集管后将采集柱至于新的
采集管中。
（9）加入 500μlAW2漂洗液，离心 8000rpm，1min，抛弃采集管后将采集柱至于新的
采集管中。 （10）离心 14000rpm，3min，以去除采集柱中的节余液体。 （11）开盖后搁置 5-10min，以去除节余乙醇。 （12）加入洗脱液 20μl，而后室温静置 5min。 （13）离心 14000rpm，1min，采集洗脱液。
新鲜组织样本（ TIANGEN ）
8000rpm 离心
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（1）新鲜组织取量 30-50mg（脾组织用量应小于 10mg），使用剪刀也许匀浆器将组织
剪碎（尽量越碎越好，形成细胞悬液），而后 10000rpm 离心 1 分钟，倒尽上清后
加入 200μl 缓冲液 GA ，震荡悬浮。
（2）加入 20μl 蛋白酶 K 溶液，混匀后在 56℃搁置，直至组织溶化（ 1-3 小时，时期
注意颠倒样本几次，以混匀使裂解充分）。
（3）短暂离心使液体聚于管底，加入 200μl 缓冲液 GB，充分颠倒混匀， 70℃搁置 10 分
钟。（加入 GB 时可能会产生白色积淀， 70℃以后会消逝变清明，假如未变清明说明细胞裂解不完全）。
（4）短暂离心使液体聚于管底， 加入 200μl 无水乙醇， 充分振荡混匀 15 秒，此时可能
会出现絮状积淀。 （5）短暂离心使液体聚于管底，将管中所有液体及絮状积淀所有加入到吸附柱中，
12000rpm 离心 30 秒，倒掉废液后将吸附柱连续放回采集管中。
（6）加入 500μl 缓冲液 GD， 12000rpm 离心 30 秒，倒掉废液，将吸附柱放回采集管
中。
（7）加入 700μl 漂洗液 PW， 12000rpm 离心 30 秒，倒掉废液，将吸附柱放回采集
管中。加入 500μl 漂洗液 PW，12000rpm 离心 30 秒，倒掉废液，将吸附柱放回采集管中。
（8） 12000rpm 离心 2 分钟，抛弃采集管，将吸附柱置于室温数分钟，以完全晾干残
余漂洗液。
（9）将吸附柱置于一个新的干净的离心管中， 向吸附膜的中间部位悬空滴加
缓冲液 TE，室温静置 5 分钟， 12000rpm 离心 2 分钟，采集洗脱液。
实验仪器及试剂的准备
50μl 洗脱
（1）打开仪器开关，仪器进行自检后，确认指示灯显示正常可以使用时，进行后续操
作，仪器待用。
（2）冰盒的准备：制备碎冰，以便搁置试剂以及冰长进行实验操作。
（3）试剂的办理：将试剂盒中的试剂置于冰上自然解冻，此中聚合酶需要插入冰中，
以保护酶的活性。
（4）移液器及耗材的准备：准备好无菌干净的移液器、吸头、
资料不可以对实验结果产生影响。
浓度测定（ PCR 法）
（1）将已解冻的试剂包含八连管、 DNA 样本、纯化水，振荡混匀后进行快速离心，而
后再置于冰上； DNA 聚合酶快速离心后置于冰上。 （2）对需要配制的试剂进行成分计算：
加入组分 PCRMIX DNA 聚合酶 纯化水 总系统
10ul
体积×（如三份样本则×） 10ul
PCR 管等，保证使用的
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（3）在 PCR 管冰架上，架上干净的八联管。
（4）将反应混杂物挨次加入八联 PCR 管中，每孔加入 18ul，而后当心盖上八联 PCR
管管盖（不要污染膜也许管盖的表面，以致影响荧光检测）。
（5）挨次加入样本 DNA 、10 倍稀释 DNA 、100 倍稀释 DNA 、标准品 DNA 、纯化水
（阴性比较）各 2ul，反应总系统 20ul。
（6）将加样后封闭好的 PCR 板或八联管振荡混匀，而后离心使液体聚于管底。
（7）按下 PCR 仪上的出舱按钮，将 PCR 板或八联管放于舱中，而后再按以下按钮进
舱送入荧光定量 PCR 仪中。
（8）仪器显示正常，而后编写反应程序，选择 SYBEGREEN 反应程序（假如是第一次
使用，请保存此反应模板，以便下次进行实验）：
第一阶段酶激活阶段： 95℃5min 第二阶段 PCR 扩增阶段： 95℃10s
60℃15s
72℃35s（荧光）
第三阶段冷却过程： 40℃10s
（9）实验结束后，选择浓度（ Ct 值）凑近标准品（ 10ng/ul）的样本 DNA 稀释度进行
下一步操作。
试剂配制及程序设置
（1）将已解冻的试剂包含八连管、样本
DNA 、纯化水，振荡混匀后进行快速离心，
40 循环
而后再置于冰上； DNA 聚合酶快速离心后置于冰上。
（2）对检测需要配制的试剂进行成分计算：
加入组分
样本 DNA/ 阳性质控 /纯化
水
DNA 聚合酶
体积
2ul
×
纯化水 总系统
依照上表计算的量配制各各样本的
10ul
MIX 混杂液。
82ul
（3）在 PCR 管冰架上，轻轻揭开八联管管盖。
（4）将 MIX 挨次加入八联 PCR 管中，每孔加入 10ul，一个 MIX 对应一条八联管，然
后当心盖上八联 PCR 管管盖（不要污染膜也许管盖的表面， 以致影响荧光检测） 。
（5）将加样后封闭好的 PCR 板或八联管振荡混匀，而后离心使液体聚于管底。
（6）按下 PCR 仪上的出舱键，将 PCR 板或八联管放于舱中，而后点击进舱送入荧光
定量 PCR 仪中。
（7）仪器显示正常，而后编写反应程序，选择 Tapman 反应程序（假如是第一次使用，请
保存此反应模板，以便下次进行实验）：
第一阶段酶激活阶段： 95℃5min 第二阶段 PCR 扩增阶段： 95℃20s
60℃40s（荧光）
40 循环
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第三阶段冷却过程： 40℃ 10s
6、结果解析
（1）软件操作流程参照 ABI7500 操作手册。
（2）实验结束此后在 FAM 通道，运转外控（ Control）Ct 值的计算，一般 Ct 值≤， 可以连续解析，假如 Ct 值＞，则说明样本 DNA 降解严重，不合适实验需求。（3）运转无模板比较（ NTC ）时， FAM 信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可
以连续解析实验状况。当 Ct 值≥时，有轻微的扩增信号，对实验的影响极微， 可以连续解析实验状况。
（4）运转阳性质控品，所有阳性质控
Ct 值一般小于，但可能会因为不一样仪器的不一样
阈值设置而发生颠簸。
（5）在 FAM 通道中运转 Ct 的计算，结果判断见下表。
E19-del
阳性 阴性 可疑
E20ins
G719X
T790M
L858R
L861Q
S768I
曲线呈 S 型
曲线呈 S 型
曲线呈 S 型
曲线呈 S 型
曲线呈 S 型
曲线呈 S 型
曲线呈 S 型
且 C≤
且 Ct≤ 且 Ct≤
无扩增曲线
且 Ct≤ 且 Ct≤
无扩增曲线
且 Ct≤ 且 Ct ≤
无扩增曲线 无扩增曲线
无扩增曲线 无扩增曲线 无扩增曲线
或 Ct 值≥
34＜ Ct＜ 35
或 Ct 值≥
34＜ Ct＜ 35
或 Ct 值≥ 或 Ct 值≥ 或 Ct 值≥ 或 Ct 值≥ 或 Ct 值≥
34＜ Ct＜ 35
34＜ Ct＜ 35 34＜ Ct＜ 35 34＜ Ct＜ 35 34 ＜ Ct＜ 35
阳性
7、质量控制
判断项目
（1） HE 染色片：实验以前一定设置 HE 切片比较并对样本进行病理评估，手术标本
须明确肿瘤组织会合地域，避开坏死和炎症组织；活检标本须保证有足够的肿瘤细胞。
（2）设置阴阳比较：每次实验以
ddH2O 作阴性比较，阳性标准品作阳性比较（均为
试剂盒内供给），以消除实验操作失误惹起的判断偏差。
实验结果无效的判断标准
（1）样本外控（ Control）没有扩增曲线，或 Ct 值＞。 （2）阴性比较出现扩增曲线，且 （3）阳性比较没有扩增曲线，或
动）。
实验结果有效性判断
（1）样本外控（ Control）出现扩增曲线且 Ct 值≤。 （2）阴性比较没有扩增曲线，或
Ct 值≥。
Ct 值＜ 35。
Ct 值＞（会因为不一样仪器的不一样阈值设置而发生波
（3）阳性比较出现扩增曲线且 Ct 值≤（会因为不一样仪器的不一样阈值设置而发生颠簸） 。实验结果判断为无效时的办理
（1）阳性比较及阴性比较信号有效而待检样本结果判断无效，则依据该标本特色，
解析可能失败的原由（除组织自己要素外），改良实验细节，重新检测。
EGFR基因突变ARMS法检测标准操作规范
（2）如比较及待检样本结果判断均不理想时，注意检查试剂合用日期，更换试剂，重
新检测。
（3）如仍没法检测出信号，确立为组织自己要素（如组织办理不妥或肿瘤成分过少）
时，应向临床或患者提出能否更换样本重新检测，如仍没法检测，应在报告中指出检测失败原由，附结果图，由主任复查后签出报告，并在《分子病理结果异常登记表》上做好登记。
8、报告内容 检测成功
依照检测结果判断，报告检测标本有无基因突变。
检测失败
除操作及试剂要素外，简要说明检测失败原由，比方：因为标实质量欠佳，扩增信号不出，未能检测 EGFR 基因突变状况。
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