含量
【摘要】 目的 建立测定复方氨基酸注射液(18AAⅤ)中17种氨基酸含量的方法。方法 采用AccQTag法，以6氨基喹啉N羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC）为衍生试剂，与复方氨基酸注射液(18AAⅤ)中17种氨基酸柱前衍生，用Waters 2695 HPLC仪器，AccQTagTM柱，以醋酸钠(pH4.95)缓冲液为流动相A，乙腈为流动相B，水为流动相C进行梯度洗脱，检测波长为248 nm，柱温为37 ℃，进样量为5 μL。结果 17种氨基酸的线性回归方程r值为0.999 6～0.999 9(n=5)，平均回收率为93.3%～104.4％（RSD值为0.88%～3.05％，n＝6）。结论 本法快速，简便，结果准确。
【关键词】 AccQTag法；复方氨基酸注射液(18AAⅤ)；6氨基喹啉N羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC）；柱前衍生化法
Contents of 17 amino acids in compound amino acid injection
CHEN Yukun,LIANG Weiyang,XUE Xiaoru,WANG Miao
(Guangdong Institute for Drug Control, Guangzhou 510180, China)
Abstract:Objective To analyze the contents of 17 amino acids in compound amino acid injection using AccQTag method. Methods The amino acids in the injections were pretreated with 6
aminoquinolylNhydroxysuccinimdyl
separately and their derivatives were analyzed on Waters 2695 HPLC using AccQTag column. Gradient eluents consisted of sodium acetate solution
(pH4.95), acetonitrile and water. The Detection wavelength was 248 nm and column temperature 37 ℃. Results The calibration curves for 17 amino acids had good linearity(r=0.9996～0.9999,n=5). The mean recoveries of 17 amino acids were 93.3%～104.4% with RSD 0.88%～3.05%(n=6). Conclusion The method is quick, simple for the content analysis of the amino acids in the injections.
Key words:AccQTag method; compound amino acid injection;
6aminoquinolylNhydroxysuccinimdyl derivatization
carbaminate(AQC);precolumn
复方氨基酸注射液(18AAⅤ)主要含17种氨基酸，包括门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、盐酸组氨酸、盐酸精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、盐酸赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。复方氨基酸注射液用于治疗由于胃肠道疾病引起的消化和吸收障碍而造成的蛋白质缺乏症；因手术创伤、烧伤而需要增强蛋白质消耗者；因某些疾病而引起的低蛋白血症；在手术前后营养不良时，增加氨基酸的供应使体内达到正氮平衡，促进伤口愈合，体力恢复；消耗性疾病或癌症因化疗引起的食欲降低，需补充蛋白质摄入的患者［1］。本文采用AccQTag方法［2，3］测定该制剂的氨基酸含量，以6
氨基喹啉N羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC）为衍生试剂与各
氨基酸柱前定量衍生后，再经AccQTagTM柱梯度洗脱。结果表明本方法具有专属性，且简便、快速、灵敏度高、重现性好。
1 试剂与试药
门冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、盐酸组氨酸(His·HCl·H2O)、盐酸精氨酸(Arg·HCl)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、盐酸赖氨酸(Lys·HCl)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)对照品均为中国药品生物制品检定所提供（批号：624—200104），质量分数均为100.0％。6氨基喹啉N羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（简称AQC）、AQC稀释液和硼酸盐缓冲液（pH8.8）均为WATERS公司提供。复方氨基酸注射液（18AAⅤ）（规格：500 mL∶16.12 g;批号：0604281、0603285，广东利泰药业有限公司提供；批号：051101，广东庆发药业有限公司提供），乙腈（色谱纯），其他试剂均为分析纯。
仪器：Waters EMPOWER色谱工作站，Waters 2695，2487检测器。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱AccQTagTM柱（3.9 mm×150 mm，4 μm）；柱温：37 ℃；检测波长：248 nm；进样量：5 μL；流速：1.0 mL/min。 流动相A：取乙酸钠（三水合乙酸钠）19.04 g，加1 000 mL水溶解，用体积分数50％的磷酸溶液调至pH5.2，加入EDTA工作液（100 mg EDTA加水至100 mL）1.0 mL，加入2.37mL（1.72 g）三乙胺，用体积分数50％的磷酸溶液调至pH4.95，0.45 μm滤膜滤过并脱气20 s，即可；流动相B：乙腈；流动相C：超纯水；按表1进行梯度洗脱。表1 梯度洗脱表(略）
2.2 标准曲线的制备
取105 ℃干燥3 h的17种氨基酸对照品，按照处方量分别精密称定，加6 mol/L盐酸溶液溶解，制成含总氨基酸浓度为250 μmol/L的贮备液。精密量取对照品贮备液适量，用超纯水稀释成含总氨基酸为5 μmol/L的对照品溶液。
精密量取对照品溶液10 μL，置0.4 cm×5 cm的小管中，加硼酸盐缓冲液（pH8.8）70 μL，混匀，加入衍生试剂AQC溶液（AQC试剂1瓶加AQC稀释液1 mL，置55℃烘箱中使溶解，即得。）20 μL，混匀，置55 ℃烘箱中10 min，即可。分别精密量取1.0、2.0、5.0、10.0、15.0 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积（A）对质量浓度（ρ）进行线性回归计算，17个氨基酸的回归方程及线性范围见表2。表2 回归方程及线性范围(略）
2.3 系统适应性试验
在上述条件下，各氨基酸的理论板数为15 738～313 955，分离度为1.4～12.4，见图1、图2。
2.4 精密度试验
取线性试验项下对照品溶液依法衍生后，连续进样6针，各氨基酸峰面积的RSD见表3。表3 精密度试验结果(略）
2.5 加样回收试验
精密量取已知含量的样品（批号：0603285）适量，加入氨基酸对照品贮备液适量，稀释成浓度分别为80％、100％、120％的溶液。按“2.2”项下试验的条件，精密量取5.0 μL进样测定，各氨基酸的平均回收率与RSD（n＝6）见表4。表4 加样回收试验结果(略）
2.6 最低检测限试验
精密量取对照品溶液适量，稀释成总氨基酸浓度为0.01 μmol/L的溶液进样5.0 μL，记录色谱图，酪氨酸(Tyr)的峰高与基线比约为3∶1，检出限为23.001 3 pg。
2.7 稳定性试验
取衍生后的样品，15 ℃中放置24 h，再次测定，所得结果与原测定结果一致。
2.8 样品测定
精密量取样品适量，稀释成含总氨基酸5 μmol/L的溶液。按“2.2”项下试验的条件，精密量取5.0 μL进样测定，记录色谱图；另取“2.2”项下对照品溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算，样品测定结果见表5。表5 3批样品测定结果(略）
3 讨 论
3.1 流动相A的pH值对结果影响较大，配制时要求pH值精确至小数点后第2位。
3.2 如衍生试剂峰大于衍生空白样中AMQ峰的80％，可能是衍生时混合不均匀，衍生时应在样品涡旋状态下加入衍生试剂，以确保充分混合。
3.3 如Gly峰与His·HCl·H2O峰的分离度不能达到要求，可能是初始梯度太陡，可减少B相梯度增量1%～2％。
3.4 如His·HCl·H2O峰与NH3峰的分离度不能达到要求，可能是初始B相第一或第二梯度太平缓，可适当增加梯度增量1%～2％。
3.5 如样品加入衍生试剂后呈黄色，则无法准确测定结果。可能是由于样品中盐的存在，导致样品未被正确缓冲，pH值偏酸性，可以通过除盐或限制取样量的方法调整溶液的pH值。也可能是由于样品水解时HCl过量导致溶液偏酸性，应在衍生反应前除去HCl。
3.6 因每台仪器与色谱柱的状态不一致，可根据具体情况对梯度进行1%～2％的小增量变化，以达到最佳分离效果。
3.7 本法简便快捷准确，精密度、重现性好，专属性强，可对样品含量进行有效的控制。
【参考文献】
［1］朱风春，翁玉文，赵玉杰.复方氨基酸注射液临床的合理利用［J］.哈尔滨医药，1996，16（4）：39-40
［2］陈华.AccqTag法测定田参氨基酸胶囊中氨基酸的含量［J］.广东药学院学报，
1998，14（2）：119-120.
［3］梁蔚阳. AccqTag法测定复方精氨酸胶囊中精氨酸的含量［J］.中国药品标准，2003，229（4）：37-38.
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