AccQ·Tag氨基酸分析方法（普通C18柱）

氨基酸分析方法AccQTag氨基酸分析方法 氨基酸分析的特点 多数氨基酸没有“显色基团” 无法用简单的方法检测 所有的氨基酸极性都很大无法反相分离 RCH N H 3 COO 需要进行处理：“衍生” 增加显色基团，提高检测灵敏度 改变样品的极性，改变分离模式 氨基酸样品衍生的目的 提高检测的灵敏度 增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度 增加荧光基团以便使用高灵敏度荧光检测器 改变分离的选择性 改变组份的基团，如： 变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离 方法？ 什么是AccQTag方法？ 什么是 方法 AccQTag方法是一种用于肽及蛋白质水解氨基 酸分析的柱前衍生技术 AccQTag方法的内容包括: 用Waters的AccQFluor衍生试剂AQC衍 生氨基酸 用反相HPLC分离衍生产物 用荧光或紫外检测器定量检测衍生产物 方法的基础 AccQTag方法的基础 AccQTag方法的基础在于专为氨基酸分析而开 发的衍生试剂-AQC6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀 酰亚氨基氨基甲酸酯 AQC是含N-羟基琥珀酰亚氨基的活性杂环氨基 甲酸酯它是一种新型氨基衍生化试剂结构如 下: H O N O N N O O AQC衍生试剂 方法对仪器的要求AccQTag方法对仪器的要求 一套Waters HPLC 梯度系统: 2690含脱气装置和柱温箱-2487和/或474检测器 _M32色谱管理系统 600_在线脱气机_柱温箱_717或7725i_2487和/或 474_M32色谱管理系统 515×2_PCM_Mixer_柱温箱_TCM_717或7725i_2487 和/或474_M32色谱管理系统 若非Waters的HPLC系统则由于泵精度和仪器 系统体积等原因可能得不到满意的分析结果 方法所需的辅助设备AccQTag方法所需的辅助设备 衍生用: 涡旋搅拌器 微量移液器1-100l 烘箱可恒温至55℃ 配制流动相用: 超声波清洗器 pH计精确到0.01 溶剂过滤装置 100ml和1000ml量筒 500ml或1000ml烧杯 纯水器可制备18MΩ无有机污染物之高纯水 方法必需化学品 AccQTag方法必需化学品 一套Waters AccQTag 化学组件包包括: 试剂盒- Waters AccQFluor 试剂盒 含有下述三种试剂各5瓶∶ Waters AccQFluor 硼酸缓冲液Buffer 1 Waters AccQFluor 衍生剂粉末2A Waters AccQFluor 衍生剂稀释液2B Waters AccQTag 氨基酸分析柱 浓液—一种预混合好的浓缓冲液 浓液 AccQTag Eluent A浓液 氨基酸水解标样—10×1ml安瓿瓶装水解氨基酸标样.每 氨基酸水解标样 Waters氨基酸水解标样 一瓶含17种水解氨基酸各2.5mM胱氨酸为1.25mM × 样品管—用于衍生样品和标样 样品管 6×50mm样品管 化学组件包使用手册 Waters AccQTag 化学组件包使用手册—详细介绍 AccQTag 氨基酸分析方法的操作及问题解答 关于 AccQFluor 试剂盒 超纯试剂级的质量控制: 超纯试剂级的质量控制 AccQFluor试剂盒中的三种试剂均经严格质量控制:原料的质 量控制超净车间的生产环境反复重结晶的工艺及产品的质量 测试确保衍生空白的背景氨基酸干扰降至最低＜2pmol Waters AccQFluor 硼酸缓冲液Buffer 1 控制三种主要污染物的含量:亚胺二乙酸＜13ppb甘氨酸＜ 8ppb丙氨酸＜9ppb Waters AccQFluor 衍生剂粉末2A 在氩气净化的隔离罩内合成经昂贵的重结晶确保氨基酸背景 降至最低 Waters AccQFluor 衍生剂稀释液2B 用低含水量＜0.003的HPLC级乙腈经去除甲醇处理＜ 50ppb 方法所需化学品 AccQTag方法所需化学品AccQFluor试剂盒需要从Waters订购AccQTag化学组件包中部分可代用的化学品: 氨基酸分析柱: AccQTag 氨基酸分析柱 基质与Nova Pak C18柱相同必要时可考虑用其代用但需筛 选并非每根都能用 液 AccQTag Eluent A液 配方为140mM乙酸钠17mM三乙胺1mg/mlEDTA二钠盐用 1:1H3PO4调至pH4.95用于紫外检测或5.05用于荧光检测0.5 NaN3防止长菌 若每天配制当日用完可不加NaN3 A液

中所需各种化学品纯度级别最好是优级纯 配制用水需高纯水或用KMnO4重蒸之蒸馏水 方法所需其它化学品AccQTag方法所需其它化学品 内标物: 内标物 α－氨基丁酸AABA 试剂级 流动相: 流动相 MilliQ 水18MΩ高纯水 乙腈 HPLC级 配制A液所需化学品: 配制A液所需化学品 浓磷酸 保证试剂 EDTA 二钠盐 A.R. 三水乙酸钠 A.R. 叠氮化钠 试剂级 三乙胺TEA A.R. 方法所需其它化学品AccQTag方法所需其它化学品过甲酸氧化法分析饲料中蛋氨酸和胱氨酸所需标样: 磺基丙氨酸 Cya 试剂级 蛋氨酸砜 MetSO2 试剂级所需试剂 液氮或干冰 甲酸88 A.R. 过氧化氢30 A.R. 氢溴酸48 A.R. AQC 衍生剂的化学性质 衍生剂化学性质: 衍生剂化学性质 可将伯氨基酸和仲氨基酸转化为稳定的荧光和紫外衍生物 AccQFluor衍生剂与伯氨基酸和仲氨基酸迅速反应生成在 395nm发射强荧光的高稳定性的脲参见下图.生成的衍生物 在室温下可稳定一周 。 可水解生成6-氨基喹啉AMQ一种不干扰测定的副产物 在一步慢反应中过量的试剂水解生成6-氨基喹啉N-羟基琥 珀酰亚氨NHS和二氧化碳参见下图.过量的试剂可在1分 钟内水解完全. 主要的水解产物AMQ在395nm的荧光很弱在色谱图上AMQ只 产生一个易于辨认的小峰NHS和二氧化碳对分析没有干扰. 对于254nm下的紫外检测AMQ峰很强大可通过调节色谱条件 将其与氨基酸检测峰分开从而不干扰测定 AQC 衍生反应机理 H H R1 O N O １°及２°氨基酸 N N N R2 N 半衰期＜1秒 N O O O 衍生后的氨基酸 AQC衍生试剂 H20 HO O 半衰期约15秒 N O NH2 HO O N-羟基琥珀酰亚胺 N CO 2 N O6-氨基鄝啉 N-羟基琥珀酰亚胺 衍生剂的配制 AccQFluor衍生剂的配制AccQFluor试剂盒中的2A瓶装有称量好的衍生剂粉末并经过检测确保仅含最低限度的氨基酸污染物用1ml乙腈2B溶解后即得10mM的AccQFluor衍生试剂.AccQFluor衍生试剂配制方法如下∶ 1.将加热装置预热至55℃ 2.在打开2A瓶之前轻轻弹击之确保所有的AccQ Fluor试剂粉末全落 在瓶底 3.由2B瓶中吸取1ml AccQFluor稀释剂并放掉以清洗微量移液管 4.吸取1mlAccQFluor稀释剂放入装有AccQFluor衍生剂粉末的2A瓶中 加盖密封 5.震荡10秒钟 6.在加热装置上加热2A瓶直至AccQFluor衍生剂粉末全部溶解。一般 不超过30分钟即可全部溶解 衍生剂的保存 AccQFluor衍生剂的保存 AccQFluor衍生试剂2A粉末可与环境中的潮气反应故 须在干燥室温环境中存放例如干燥器内若用真空干燥器 更好不要置于冰箱中保存尤其不能置于冰室内 已用乙腈溶解后的2A溶液使用时亦应注意防水防甲醇及 样品污染最好用干燥的吸液管吸取衍生试剂每衍生 一个样品更换一个新的吸液管 未用完的试剂亦应放在干燥器内保存最好在一周内用完 新配制的2A试剂是无色透明清液若溶液变色或有沉淀析 出说明有部分试剂降解失效或被污染 外标法标样制备和保存AccQTag化学组件试剂包中提供17种水解氨基酸的标 样每种氨基酸除Cys2以外的浓度均为

2.5mMμm/ml取40μl水解氨基酸标样置于清洁的自动进样瓶中加入 960μlMilli-Q水混匀.此标样含胱氨酸50pmol/μl等 价于100pmol/μl半胱氨酸含其它各种氨基酸均为100 pmol/μl。定量测定时需根据未知样的浓度将标样稀释成不同浓 度才能得到合适的标准曲线 储存∶此校正曲线用标样在－20℃可保存一个月剩余的水解 氨基酸标样密封在－20℃可保存三个月未开封的水 解氨基酸标样安瓿瓶在4℃可保存一年。 内标法标样制备标准储备液制备:标准储备液制备标准储备液制备1.α－氨基丁酸AABA内标储备液: 2.5μmol/ml 称取25.8mg AABA 置于100ml容量瓶中 用18MΩ 高纯水稀释至刻度。2.磺基丙氨酸Cya储备液2.5μmol/ml 称取4.23mg Cya 置于10ml

容量瓶中 用18MΩ高纯 水稀释至刻度。3.蛋氨酸砜 MetSO2 储备液2.5μmol/ml 称取4.53mg MetSO2 置于10ml容量瓶中 用18MΩ高 纯水稀释至刻度。 内标法标样配制制备稀释标准储备液:制备稀释标准储备液制备稀释标准储备液 取1ml水解氨基酸标准液Pierce H与4mlMilliQ 高纯水混合 制成0.5μmol/ml的氨基酸标准液。工作标准液制备:工作标准液制备工作标准液制备 将不同体积的稀释标准储备液 AABA内标储备液和MilliQ水混合 制成一系列不同浓度的氨基酸标准液. 例如: 移 液 名 称 移 液 体 积 μl 稀释标准储备液 200 800 1200 1600 1800 AABA内标储备液 200 200 200 200 200 MilliQ水 1600 1000 600 200 0 这样制成具有固定浓度内标物AABA 0.25μmol/ml的0.05 0.20 0.30 0.40 0.45μmol/ml 的标准氨基酸工作液。备用 饲料样品的酸水解: 饲料样品的酸水解:仔细地研磨碎样品 60目筛筛过。仔细地研磨碎样品 然后用 60目筛筛过。仔细地研磨碎样品酸解:酸解酸解: 1.称100mg 筛过的样品准至0.01mg 放入2.5×150 mm水解试管中 2.加入 10ml 6N HCl 3.在此试管开口2cm处放在火焰上拉制成薄颈 4.用液氮或干冰冷冻样品直至固化 5.将试管抽真空直至真空计低于 50 毫乇 7 Pa 6.在真空下密封此试管 7.在110 ±1℃ 水解 22小时。