激光扫描共聚焦显微镜（Confocallaserscanningmicroscope，简称CLSM）是近代生物医学图像仪器。它是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针。
利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。
二、激光扫描共聚焦显微镜原理
在普通宽视野光学显微镜中，整个标本全部都被水银弧光灯或氙灯的光线照明，图像可以用肉眼直接观察。同时，来自焦点以外的其他区域的荧光对结构的干扰较大，尤其是标本的厚度在2um以上时，其影响更为明显。
激光共聚焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。组织样品中如果有可被激发的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管（PMT）探测收集，并将信号输送到计算机，处理后在计算机显示器上显示图像。在这个光路中，只有在焦平面的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不
能通过小孔。因此，非观察点的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔与探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。以激光作光源并对样品进行扫描，在此过程中两次聚焦，故称为激光扫描共聚焦显微镜。
三、激光扫描共焦显微镜的优点1.动态连续扫描及三维图像重组。
LSCM可以对对活细胞和组织或细胞切片样品的不同层面进行连续逐层扫描,来获得各个层面的图像，即所谓的“无损伤的光学切片”。激光扫描共聚焦显微镜扫描的每个层面之间的间距可以达到0.1um甚至更小。获得的图像通过计算机重组，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。与普通光学显微镜获得的图像相比，LSCM所得到的重组三维图像清晰度高、立体感强,可通过计算机软件对细胞内所研究的结构进行各种测量，对细胞内的空间结构和某些物质在细胞内的定位方面的研究中有广泛的应用。
2.同时多种物质标记。
利用LSCM，通过对膜上、胞浆内多种物质的荧光标记，可以实现在同一样品上同时进行多重物质的观察，比如检测细胞内钠、钙、镁等离子浓度的比率及动态变化。
3.瞬时分辨率高。
可以实时动态观察活体组织标本。LSCM的荧光检测器可以毫秒级或微秒级的速度检测荧光，即其时间分辨率极高，能对细胞内的分子进行功能性动态观察。LSCM技术可对活细胞在无损伤处理的情况下进行观察，跟踪活细胞内的物质或结构和生理过程随时间变化的情况，得到实时动态的连续图像。
4.高质量数字图像。
普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。LSCM以激光为光源，激光具有单色性强、方向性好、高亮度﹑相干性好等优点，可以避免普通显微镜的缺点。一般常用的气体激光器如氩（Ar）﹑氪（Kr）﹑氦（He）﹑氖（Ne）。由于LSCM的样品焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样就避免了传统光学显微镜由于光散射造成的图像信噪比降低，图像清晰度和分辨率不高的缺点。而且，LSCM的图像是以电信号的形式记录下来的，可以采用各种模拟的和数字的电子技术进行各种图像处理。
四、激光扫描共焦显微镜的结构
典型的激光扫描共聚焦显微镜系统构成由激光光源，扫描头，显微镜、计算机控制系统、图像信息储存及输出设备等组成。由此可见，如果仅从对图像的显微放大能力而言，LSCM仍然取决于系统所采用的光学显微镜本身的放大倍数，LSCM的最大优点是利用特殊设计的
共聚焦技术进行活细胞的无损伤测定，并将所采集的“光学切片”进行三维重建工作。
1.激光光源
激光扫描共聚焦显微镜可以配备各种激光光源，因而可以在各种波长下工作，新的激光器在不断产生，从21nm-7mm，已经有数千个激光波长可以利用。目前主要的单光束激光激发波长在350-700nm范围内，覆盖了紫外到远红光波段。
2.扫描器系统
扫描器内密封有检测针孔光栏、分光镜、发射荧光分色器及检测器。
图一共聚焦显微镜工作原理示意图
由图可见，荧光样品中的混合荧光进入扫描器，经过检测针孔栏、分光镜和分色器选择后，被分成各单色荧光，分别在不同的荧光通道进行检测并形成相应的共焦图像，同时在计算机屏幕上可以显示几个并列的单色荧光图像及其合成图像。
（1）针孔：共聚焦显微镜中的一个重要组成部分，它是放在检测器及激光光源前面的一个小孔，作用是控制光切片的厚度，对实现断层扫描成像，排除焦面杂散光起关键作用。
（2）分光镜：作用是按照波长来改变光线的传播方向。（3）发射荧光分色镜：作用是选择出一定的波长范围的光进行检测，不同型号的仪器采用的分色器的部件有所不同。目前用于分色器的部件主要由滤光片、棱镜和光栅三种类型。
（4）检测器：采用高灵敏度的光电倍增管，其检测的范围和灵敏度可根据强度进行连续调节。
3.荧光显微镜系统
荧光显微镜是激光扫描共聚焦显微镜的一个重要的组成部分。它配备两个光源：卤素灯光源和汞灯光源，主要是用于预览样品，其中卤素灯光源用于寻找样品焦平面、观察样品位置、形体和分布；汞灯用于观察和分辨样品中产生荧光物质的成分和位置。对于光敏如淬灭的样品最好用卤素灯进行预览，以减少对样品的刺激。
用于LSCM的荧光显微镜：侧面有扫描器接口，装有微量步进马达，有防振装置，有光路转换装置，配高数值孔径的物镜。
4.计算机系统
LSCM的计算机系统需要配置大容量的硬盘，装备各种专用软件，具有强大的图像采集、记录、加工和系统控制等功能，并利用图像处理软件进行三维重建工作，同时也可以利用实时监测软件，在一定的时间间隔自动扫描，获得随时间序列而变动的一系列三维图像，被称为“四维”图像功能。
在数据采集界面中，除了菜单栏的各种子目录外，在控制面板上可以方便地对扫描区域、速度、镜头匹配及聚焦倍数、噪声信号过滤等进行设定，对光学切片的步进距离、起止位置等聚焦马达的控制、PMT的光圈、增益、背景亮度等通过滑块来调整、设定。也可以通过控制面板上的按钮方便地启动或终止扫描、存档、三维图像加工或测量、打印等操作。
5.图像信息的记录及输出设备
在本系统内装备了各种记录及输出设备，可以方便地对研究对象的图像信息进行记录加工和输出。例如，可配置拷屏机将计算机屏幕上显示的图文信息完全拷贝到照相机上，做到“所得即所见”。也可以将经过计算机加工过的感兴趣图像或测定结果以彩色或黑背的形
式打印出来。最后，所有测定结果或图像资料也可在计算机上以光盘录制的方式记录下来长期保存，或留待将来分析使用。
五、激光共聚焦显微镜样品的制备1.样品的预处理
样品的预处理包括给药、切片或细胞标本的制备。其中给药过程要根据实验目的来进行，在这里主要介绍切片和细胞标本的制备。
（1）组织切片样品的处理
其制作过程主要包括组织样品固定、切片制作。组织切片的优点是能够完好地保存细胞间的相互关系和结构，因此是生物医学实验中应用广泛的样品形式。用于共聚焦显微镜测定的切片形式有：活的组织切片、冰冻切片及固定切片。活的组织切片无需固定，活体直接切片后用于观察或测定组织具有活性状态下的一些生理指标。该类切片的缺点是保存条件要求高、时间短，切片比较厚，深层不容易染色。冰冻切片的优点是荧光背景低，引入杂质干扰少，常用于免疫荧光的标记和检测。固定的组织切片的优点是易进行多种操作、样品易保存，缺点是容易引入干扰荧光和引起组织结构形态的改变，因为制备固定的切片过程中，有一些固定剂会带入或加强干扰荧光，影响后面的荧光标记和测定步骤，所以使用时要注意组织样品固定剂的选择。
（2）细胞标本的制备
荧光标记前细胞标本的制备过程包括细胞的培养和细胞的预处理等步骤，细胞的培养和预处理要注意细胞种类和纯度、密度、细胞形态等应符合实验目的。
①细胞种类和纯度。实验所选用细胞的种类一般是由实验目或测定指标决定,但是有时会出现细胞种类不纯的现象,杂细胞的干扰会导致错误的实验结果,这种现象在原代分离和培养的细胞中尤为常见。例如原代培养的血管平滑肌细胞中,容易混合有内皮细胞和成纤维细胞:大脑皮层神经元易与胶质细胞相混合,因此实验中应注意签别细胞的种类和纯度,采用相应的方法对细胞进行纯化。
②细胞密度和形态。实验中调整不贴壁细胞和贴壁细胞的细胞密度的方式是不相同的。不贴壁细胞包括直接消化分离的细胞和悬浮生长的细胞,其密度可以通过改变细胞数与溶液体积的比例来调节。贴壁细胞的密度由其细胞种类、接种密度、细胞铺展面积及间距、细胞增殖速度、生长的时间等来决定。从贴壁细胞的生长方式看,有些是细胞相互连接成片地生长;有些则可以分散成单个细胞生长。要根据实验目的调整细胞接种密度。如果实验目的是对细胞个体进行形态学观察、三维重建、定位荧光信号,则细胞密度可以稀疏一些,这样可以使细胞充分伸展,显示出应有的形态和结构,但也要注意保证显微镜视野内有一定数目的细胞,以便能够观察和统计多个细胞,选取出有代表性的形态结构,反之如果细胞密度过低,细胞数少,则缺少观察过程中的统计意义,而且荧光染色后上机测定时,寻找细胞花费时间太
多,激发光长时间照射易引起荧光灭;这就要求细胞所占面积要不低于视野20%。如果实验目的是动态或静态定量测定荧光强度时,则细胞的密度应该高一些,以便做大量细胞的统计定量,细胞约占视野面积的80%,这时观察分散生长的细胞可以看到细胞布满视野但相互间又有空隙、尽量不连成片。无论单个生长还是成片生长的细胞密度不能太高,要保证细胞不聚堆拥挤,以防止细胞相互间荧光互映和挤压变形,影响定量结果。
2.用荧光探针标记样品
标记方式：直接标记，生物样品与荧光探针直接作用，使样品具有荧光。间接标记法：荧光探针将某些特定分子标记，这些特定分子再与细胞作用，使样品具有荧光，如免疫荧光法，荧光标记的药物。显微注射法：利用显微注射向细胞内导入荧光探针，此法得到的荧光细胞少，适合监测少量细胞。膜通透法：利用透膜剂，低渗培养液短期刺激增强探针跨膜能力，从而使探针进入细胞中。确定荧光探针标记样品的条件：标记探针的浓度，反应温度，时间等。
3.荧光探针标记的注意事项
荧光强度过高：看不清细胞结构细节，不利于形态观察，可降低探针浓度，减少反应时间。
荧光强度弱：荧光探针浓度过低，标记条件不当，探针溶解不充分，探针选择错误等。
在操作过程中，避免对样品造成损伤防止影响实验结果；荧光标记要避光进行。防止非特异性标记，设立正确的对照组。荧光标记后要尽快上机采集图像。
六、激光共聚焦显微镜与光学显微镜之比较
光学显微镜的基本结构主要由机械部分、照明部分和光学部分（反光镜、聚光镜、光圈、目镜、物镜等）组成。激光扫描共聚焦显微镜（LSCM），基本结构比光学显微镜要复杂，它除了包括光学显微镜部分之外，主要由激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统（包括数据采集，处理，转换、应用软件）、图像输出设备、光学装置和共聚焦系统（如光学滤片，分光器，共聚焦针孔及相应的控制系统）等部分组成。由此可见，两种显微镜在构造上最大的区别就在于LSCM具有结构复杂的计算机系统、激光系统、扫描装置和共聚焦系统。
1.光源。
在光源方面，由于两者性质的不同，所成像的清晰度也有明显的区别。光学显微镜的光源大致可分为两类，一是自然光，一是内置灯源。可见光经反光镜、聚光镜的作用，对全视野进行照明，即场光源，也就是说它只能对标本局部厚度作平面成像，这样不仅要求标本为薄切片（5～10μm），而且标本上任何一点的图像都会受到邻近点的衍射光和散色光的影响，降低了图像的反差和分辨率。LSCM采用单色激光作为光源，并用附设的小孔光阑2针孔（pinhole）使光源成
为点光源，与光学显微镜的场光源相比，共聚焦显微镜的点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。LSCM除了在照明光源前有一个针孔（pinhole）外，在检测器前方也有一个针孔，光源针孔和检测针孔的位置相对于物镜焦平面是共轭的，也就是光点通过一系列的透镜最终可同时聚焦于光源针孔和检测针孔，也就是所谓的“共聚焦”。
2.分辨率。
光学显微镜的分辨率可用物镜的分辨率来表示，根据阿贝公式：分辨率δ=0.61λ/nsinα，式中λ—光波在真空中的波长，α—透镜孔径角的一半，n—透镜和物体间介质的折射系数。目前技术上nsinα最大可达成1.5，根据上式分辨率约为0.4λ。由此可见光学显微镜的分辨率受到衍射效应的限制，最终只能达到约为照明波长的0.4倍。此外，光学显微镜不仅从焦平面上收集光量，而且还收集来自焦平面上、下的光量，使分辨率大大降低。与光学显微镜相比，LSCM的分辨率除了与光的波长有关外，主要取决于针孔的直径与物镜的数值孔径。由于有针孔(pinhole)的存在，所用的光源和检测器都是点状的，只有来自焦平面的光可以参与成像，而其它来自焦平面上、下的光由于不能进入针孔而不能参与成像，使分辨率较光学显微镜大为提高。此外，由于扫描装置的存在，使得LSCM不但具有横向分辨率，还具有纵向分辨率。不但增加了同一平面两点间的分辨率，也使得各横断面的图像也能清楚显示。
3.扫描和检测装置。
扫描和检测装置是LSCM的重要组成部分，台阶扫描和光束扫描（或镜扫描）是目前广泛应用的两类扫描装置，而检测器主要有光电倍增管（PMT）和电感偶合器（CCD）。在一台LSCM中，光源照射的方向、强度、时间，各种方式的扫描，光学器件如滤光片轮转换，检测器增减，共聚焦针孔孔径大小的转换以及检测信号的放大、采集、转换、处理直至成像、输出等一系列复杂工作，都由计算机协调控制和完成。由于LSCM能随时采集和记录检测信号，因此它能对活细胞进行实时动态检测，而普通光学显微镜却无这些功能。
4.样品制备。
光学显微镜由于要求样品较薄，因此制样过程较为复杂。由于LSCM的扫描面积最大为10cm×8cm，加之LSCM同时具有横向和纵向方辨率，因此，标本可以较厚和较大，LSCM既可观察石蜡或冰冻组织切片，也可观察较厚的切片，后者不需石蜡包埋或冰冻处理，也不需专用的组织切片机或冰冻切片机切片，因而制样过程较简单方便。由于组织厚片的制作快速简便，因而无须固定液的固定处理，使得新鲜活组织细胞的观察和动态变化的检测成为可能。由于组织厚片的制作不需常规的包埋、切片等繁琐的过程，因而最大程度地维持了细胞组织的正常形态和生理功能。加之众多的特异荧光探针的发展，使得人们可以方便地研究和观察组织细胞的特异结构、分子、离子、以及生物学行为等重要的问题。
七、激光扫描共聚焦显微镜使用中的常见问题
激光扫描共聚焦显微镜与普通显微镜相比，激光共聚焦采用了能到达最高分辨率及重复性的无色差扫描技术，能产生真正具有三维清晰度的图像，而且还可以处理活的标本并不对标本造成物理化学特性的破坏。但复杂的软件和多功能操作过程中多会出现以下问题。
1.扫描最终像清晰度不高
造成扫描最终像清晰度不高此类问题的原因主要有两个：（1）物镜和ZOOM值选用不正确。初学使用者大多喜欢选用IOX物镜后，再将ZO0M值调到所需要的最大值。通过ZOOM值韵增大确实可以将图像放大，有助于看清图像的细节，但是zO0M的增大是有限定的，这取决于物镜的倍率。例如在10X物镜下，ZOOM值超过lO就没有意义了，而且ZOOM值的增大属于电子放大，放大倍数越高，清晰度越差。所以在所观察的样本形态体积较小的情况下，多采用高倍物镜（例如63X水镜或油镜），再适当调整ZOOM值，Z00M值以不超过2为佳。
（2）误将Z—Position旋转球的功能和显微镜焦距微调旋转器的功能等同。在准确调焦的基础上，通过Z—Position旋转球的左右调节，可以观察到目标样品图像由Z轴距离变化而引起的图像清晰度的改变，感觉上和通过调焦使图像变清晰一样。因此很多使用者在没
有调焦准确的情况下，直接使用一Position旋转球来调整图像清晰度而导致成像模糊。
2.扫描背景强。图像质量差
解决这个问题的关键在于要根据样品的制备质量选取合适的针孔大小，调整激光管电压，光电倍增管功率，信噪比等参数到最佳状态。这些参数或设置有非常密切的关系，选择时应该综合考虑；或者是在扫描时使用Aver键和Li。Ai。键（即简单的数学平均方法）进行图像平滑减噪，另外一个方法是在此基础上，图像扫描完成后通过LCS软件中的图像处理功能键来调节亮度，对比度和进行灰度校正以及通过基线校正去除噪音，使图像质量最佳化。还有一种明场出现环状波纹背景的情况是由于操作者在使用显微镜观察荧光样品后，没有将荧光滤镜退出并切换到扫描状态所致。此时只需要转动调节轮至Scan即可。
3.串色
在使用多种荧光染料标记样品时或是样品本身有很强的自发荧光时，串色的现象就很容易发生。串色又分为两种情况：
（1）两种荧光染料的激发光谱没有重叠，但是吸收光谱有重叠。这类串色可以通过顺序扫描（又称序列扫描）来完成：即先使用一种荧光染料的激发光扫描一张图片，再使用另外一种荧光染料的激发光扫描第二章图片。
（2）两种荧光染料的激发光谱和吸收光谱都有重迭，这种情况只能通过光谱扫描解决。
4.多荧光通道扫描图像的保存及标尺数值的取整
在多通道扫描图像存盘时，系统默认以不同单通道的颜色分别保存。为了便于直观的观察各种荧光在不同部位的表达，我们还需要一张各种荧光叠加的合并图像，此时点击Overlay键即可。在单次扫描图像完成后，系统自动生成的标尺数值多数情况下为非整数，即使在图像保存前修改为整数，但一经后续扫描，前幅图像中修改过的标尺数值又会恢复到默认的非整数值。解决这个问题也需要用到Overlay功能键，即在单次扫描完成并将标尺数值修改取整后，点击O—verlay键显示合并图像，再右键点击选中图片，使之生成Snapshot图像即可。这两点是初学使用者很容易忽视的。
5.在图像扫描完成后。各种参数忘记复位
特别是电子放大扫描以后，很多操作者都忘记将ZO0M还原，这就造成在下一个样品扫描时无法在显示屏上观察到目标样本。
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