不同接种时期对三个无核葡萄品种胚珠培养的影响

维普资讯 http://www.cqvip.com 不同接种时期　对三个　无核葡萄品种　胚珠培养的影响　郭景南，刘崇怀，冯义彬，潘兴，樊秀彩，李民　（中国农业科学院郑州果树研究所，郑州４５０００９）　摘　要：以自然授粉的３个假单性结实类型（种子败育型）无核葡萄品种为试材，在初花期后不同时　间采回幼果，取出幼胚接种在发育培养基中进行离体培养，研究不同接种时期对胚珠发育和萌发状况的影响。　结果表明，奇妙无核在初花后５０～５４ｄ接种，胚珠发育率在５０．０％以上，最高可达７１．０％，随着时间的推移　其发育率迅速下降；红宝石无核在初花期后５１ｄ接种，发育胚百分率最高达６３．３％，其后百分率逐渐降低。　２个品种的合子胚从产生到败育可跨越３５ｄ左右的时间。因此，奇妙无核与红宝石无核非常适合用于无核品　种的胚培养。布朗无核胚败育的时期到来的早，且胚的发育率均远远低于其他２个品种，不宜用作胚培养。　关键词：无核葡萄；接种时期；胚珠培养　中图分类号：Ｑ　８１３．７　文献标识￣ｉ５－：Ａ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｄａｔｅｓ　ｏｎ　ｏｖｕｌｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｓｅｅｄｌｅｓｓ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ　Ｇｕｏ　Ｊｉｎｇｎａｎ，Ｌｉｕ　Ｃｈｏｎｇｈｕａｉ，Ｆｅｎｇ　Ｙｉｂｉｎ，Ｐａｎ　Ｘｉｎｇ，Ｆａｎ　Ｘｉｕｃａｉ，Ｌｉ　ｍｉｎ　（Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ　Ｆｒｕｉｔ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ　４５０００９）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｄａｔｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｖｕｌｅ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｒｅｅ　ｓｅｅｄｌｅｓｓ　ｇｒａｐｅ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ　ａｓ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ　５０－５４　ｄａｙｓ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｉｔｉａｌ　ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ　ｐｅｒｉｏｄ，ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｏｖｕｌｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　Ｆａｎａｓｙ　Ｓｅｅｄｌｅｓｓ　ｗａｓ　ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　５０．０％ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｒａｔｅ　７　１％．ｂｕｔ　ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｒａｔｅ　ｄｅｓｃｅｎｄｅｄ　ｒａｐｉｄｌｙ．Ｆｏｒ　Ｒｕｂｙ　Ｓｅｅｄｌｅｓｓ，ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｄａｔｅ　ｏｆ　ｏｖｕｌｅ　ｗａｓ　５　ｌｄａｙｓ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｉｔｉａｌ　ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ　ｐｅｒｉｏｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｏｖｕｌｅ　ｗａｓ　６３－３％，ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｒａｔｅ　ａｌｓｏ　ｄｅｓｃｅｎｄｅｄ　ｒａｐｉｄｌｙ．Ｉｔ　ｎｅｅｄｅｄ　ａｂｏｕｔ　３５　ｄａｙｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｅｍｂ￣ｏ　ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ　ｔｏ　ａｂｏｒｔｉｎｇ　ｆｏｒ　Ｆａｎａｓｙ　Ｓｅｅｄｌｅｓｓ　ａｎｄ　Ｒｕｂｙ　Ｓｅｅｄｌｅｓｓ、Ｓｏ　ｔｈｅｙ　ｗｅｒｅ　ｖｅｒｙ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｏｒｆ　ｏｖｕｌｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｓｅｅｄｌｅｓｓ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ．Ｂｒｏｎｘ　Ｓｅｅｄｌｅｓｓ　ｗａｓ　ｕｎｆｉｔ　ｏｒｆ　ｏｖｕｌｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｂｅｃａｕｓｅ　ｉｔｓ　ａｂｏｒｔｉｖｅ　ｄａｔｅ　ｃａｍｅ　ｅａｒｌｉｅｒ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｏｖｕｌｅ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　Ｆａｎａｓｙ　Ｓｅｅｄｌｅｓｓ　ａｎｄ　Ｒｕｂｙ　Ｓｅｅｄｌｅｓｓ、　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｓｅｅｄｌｅｓｓ　ｇｒａｐｅ；ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｄａｔｅ；ｏｖｕｌｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　无核葡萄因其经济价值高，食　母本基因型、培养条件等均显著影　宜的接种时期，必将大大提高离体　用方便而倍受欢迎，但其品种数量　响胚珠的存活及萌发，本研究针对　胚培养的效率。无核葡萄胚珠培养　却远远不及有核品种，可向种植者　影响无核葡萄胚珠培养的重要因　的相关内容已有多篇报道¨。］，但　提供的栽培品种更是十分有限。无　素之一取材时期进行了胚珠　有关红宝石无核、奇妙无核等品种　核葡萄的胚发育和败育的现象比　存活及萌发情况的离体培养试验。　的接种时期对离体胚发育影响的　较复杂，取材时期、培养基类型、　掌握不同品种在胚败育之前最适　研究尚未见报道。本试验旨在探讨　收稿日期：２００８—０３—０３　基金项目：国家科技攻关资助项目（９５—０１４—０ｌ一０５）；国家科技基础性工作重点资助项目（１９９９—２００４）。　作者简介：郭景南，女，副研究员，硕士，从事葡萄种质资源的收集、保存、鉴定、评价与创新工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｕｏｊｉｎｎａｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ　２　０　０　８．０　３　２１　维普资讯 http://www.cqvip.com 红宝石无核、奇妙无核等品种的适　绿色胚珠作为发育胚统计，然后将　是在胚发育程度较高，而存活的胚　宜接种时期，以期获得较多数量的　正在发育的胚珠转入萌发培养基。　也比较多的时期［８］。从表１可以看　杂交后代植株。　萌发培养基：以半量式ＭＳ培　出，奇妙无核在初花后５０～５４ｄ接　养基为基本培养基，添加６－ＢＡ０．５　种，绿色胚珠百分率在５０．Ｏ％以上，　ｍｇ／Ｌ、ＩＢＡ　０．２　ｍｇ／Ｌ，ｐＨ５．８，每　最高者可达７１．Ｏ％，然后随着时间　１材料与方法　１．１材料　红宝石无核、奇妙无核葡萄试　瓶接种３～４粒。　的推移，其发育率基本在４０．Ｏ％以　材取自国家果树种质郑州葡萄圃　布朗无核试材取自郑州果树研究　所植物生长调节剂课题组试验地。　３个品种的果实均来自盛果期自然　授粉树。　１．２方法　２００５年从落花后１个月开始，　每隔３ｄ，用单面刀片将胚珠横刨。　当胚珠横切面呈无色晶状体时采　回果穗，确定为首次取样期，然后　每隔１ｄ取１次样，一直持续至胚珠　变褐，胚珠内变为空腔为止。　１＿２．１胚珠发育培养　将果粒用清水冲洗数次后，在　无菌超净工作台上用７０％一７５％　酒精消毒１ｍｉｎ，０．１％升氯化高汞　（升汞）溶液消毒１０　ｍｉｎ，最后用　无菌水冲洗３次。将消毒后的果粒　切开，取出胚珠，用解剖刀轻轻切　去喙，接种于直径为９０ｒａｍ的培养　瓶中，内装２０ｍＬ胚发育培养基。在　温度２５（±１）℃，每日光照１５ｈ、　光强２０００Ｌｘ的条件下培养。　发育培养基：以Ｎｉｔｓｃｈ为基本　培养基，添加ＩＡＡ　２．０ｍｇ／Ｌ、ＧＡ　０．４ｍｇ／Ｌ，蔗糖２％，活性炭０．１％，　ｐＨ５．８，每瓶接种６～８粒。　１．２＿２胚珠萌发培养　红宝石无核培养３４—６３ｄ，奇　妙无核与布朗无核分别培养３４～　５０ｄ、３４ｄ后转入１～５℃低温条件　下。２个月后统计胚珠发育率，将　２结果与分析　下，并表现为迅速下降趋势，该结　２．１不同接种时期对奇妙无核胚珠　果证明了无核葡萄胚珠发育过程中　生长发育的影响　存在一个急剧败育期　的推测。此　接种时期的选择依据离体胚的　外，该研究的最适胚挽救期与已发　培养效果而定。一般植株上形成合　表的将浆果开始软化期作为接种最　子胚的能力越强，合子胚数量越　佳时期的研究基本一致　。　多，胚发育程度越高，离体胚的发　２．２不同接种时期对红宝石无核胚　育率、萌发率和成苗率则愈高。但　珠生长发育的影响　对同一品种来说这两者存在矛盾，　红宝石无核合子胚从产生到　即合子胚存活数量多的时期，其胚　败育需很长一段时间。从表２可以　的发育程度低，培养困难；合子胚　看出，初花期后７１ｄ时绿色胚百分　发育程度高的时期部分胚已败育，　率仍可达２７．８％。赵密珍等¨叫认　存活的胚减少，离体培养胚的发育　为，在落花后４２ｄ，即初花后５２ｄ　率降低。因此，最佳接种时期应该　时，胚珠纵径达到最大，为３．４８ｍｍ，　表１奇妙无核不同接种时期胚珠生长发育情况　维普资讯 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表２不同接种时期对红宝石无核胚珠生长发育的影响　姆劳德（Ｈｉｍｒｏｄ）比布朗无核　（Ｂｒｏｎｘ　ＳｅｅｄｌｅＳ　Ｓ）、累克芒特　（Ｌａｋｅｍｏｎｔ）成熟早，其胚珠败育的　速度也较快【９１。布朗无核的成熟期　比奇妙无核和红宝石无核早，故其　胚发育率均远远低于这２个品种，　这与已发表的研究结论一＿致［　，因　此布朗无核不宜用作母本进行胚　培养。　２．４不同品种的胚珠萌发情况　由表４可见，奇妙无核与红宝　石无核的胚珠萌发率分别为１　３．７％、　９．９％。其中，红宝石无核的胚珠萌　发率与已报道的数据１６．０％基本　接近¨ｏ】，而奇妙无核没有查到相关　的研究资料。但红宝石无核的非正　常萌发率为奇妙无核的３．２倍，显　然有些偏高，这可能是由于红宝石　无核是一个极晚熟品种，需要更长　的胚发育时间。相关研究认为，红　宝石无核胚发育时间相对较长，约　为１２０ｄ左右¨ｏ】，本研究仅用了３４—　６３ｄ，即在本研究中，该品种的胚　珠最长发育时间仅为６３ｄ。　口　叩　接种胚　胚珠萌　百分　正常萌百分率　畸形　百分率　珠个数　发总数率（％）　发数　（％）　萌发数　（％）　３结论与讨论　３．１奇妙无核属中熟品种，与无核　白的开花期和果实成熟期基本相　同。奇妙无核在距初花期５０ｄ时，　胚发育率为５２．２％，历经２２ｄ后胚　但此时幼胚有的已停止生长，色泽　正常授粉受精，合子胚具有一定的　发育率仍保持在１１．９％。李桂荣研　变暗，趋于衰败。由表２可见，红　发育能力。但是，奇妙无核和红宝　究认为，无核白在花后３７—４３ｄ为　宝石无核在初花期后５１ｄ，绿色胚　石无核不同接种时期的绿色胚平　取材的最佳时期［１ｌ１，以此推理，奇　百分率最高达６３．３％，随着时间的　均百分率分别达３０．１％、２８．７％，而　妙无核可用于取材的时间为２９～　推移，其百分率在逐渐降低，与已　布朗无核仅为４．８％，其原因除了　３５ｄ。红宝石无核在距初花期５　１ｄ　有的研究基本吻合。　２．３不同品种的胚珠生长状况　所选发育培养基有可能不适合该　时，胚发育率为６３．３％，在距初花　品种外，主要决定于该品种的不同　期７１ｄ时为２７．８％，２者相距２０ｄ。　从表３可以看出，奇妙无核、红　基因型。有研究认为，成熟早的品　赵密珍研究认为，花后３５ｄ是红宝　宝石无核、布朗无核３个品种均可　种胚败育的速度快，如京早晶、希　石无核胚挽救的最佳时期【ｌ０】，那么　维普资讯 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意味着本试验的接种日期至少可　葡萄培挽救具有重要的影响。郭修　２８３　再提前１６ｄ，即该品种胚挽救可先　武研究认为，取样接种时期的极差　［６】亓桂梅，潘春云，汤小宁，等．无　后延续３６ｄ左右。因此可以认为，　值（Ｒ值）远远大干培养基类型、生　核葡萄杂交胚珠的培养技术［Ｊ１．果树　同一品种胚的发育和败育不是同　长调节剂（６－ＢＡ￣ＮＧＡ　）因子的影　学报，１９９８，１５（４）：３６４—３６７　步的，２个品种的合子胚从产生到　响作用，表现出对胚挽救效果影响　［７】陈香波，曹孜义．离体葡萄未成　败育基本上可跨越３５ｄ左右的时　的极显著性　。Ｐ．Ｓｐｉｅｇｅｌ—Ｒｏｙ也认　熟胚成苗途经研究［Ｊ】．果树学报，　间，所以说这２个品种非常适合用　于无核品种的胚培养。　３．２本研究中，奇妙无核、红宝石　无核绿色胚百分率分别为３０．１％、　２８．７％，胚珠萌发百分率分别为　１３．７％、９．９％，均表现偏低。其原　因可能有二一是胚珠在发育培养　基上的培养时间过短。过早将胚珠　放入低温处理，胚珠在培养室内培　养的时间过短，致使胚不能完成正　常的生长发育二是低温处理温度　偏低。在转入萌发培养基时，常以　胚珠是否保持绿色来作为成活的　标志。本研究放入５～８℃冰箱的绿　色胚珠百分数可达５２．０％，而放入　冰柜的绿色胚珠百分数仅为２７．１％。　从切开的褐色胚珠可以看到，绝大　多数的种胚饱满，颜色呈鲜亮的乳　白色，说明种胚发育良好，是休眠　时的偏低温度导致的种皮发褐，因　无法判断发育胚与败育胚而丢弃　了一部分正在发育的胚。　３．３有研究认为，布朗无核盛花后　４９ｄ是适宜的接种时期　１，本研究　在初花期后４５ｄ接种，接种时期可　能有些偏早。布朗无核在郑州５月　１６日左右开花，８月ｌ０左右成熟，　属中早熟品种。本研究的胚珠仅在　发育培养基上培养了３３ｄ即转入低　温处理阶段，推测发育培养时间短　也是失败的原因之一。　３．４取样时期。接种时期对于无核　为，粉红无核在花后４９ｄ取样比花　２０００，１７（４）：２６１—２６４　后２８ｄ的效果好【ｌ　１。每个品种的接　［８】孟新法，张利，张潞生，等．无核　种时期均不一样，表现出一定的多　葡萄胚发育及早期离体培养的研究　样性。　ＨＩ．胚殊接种时期对胚发育的影响［Ｊ】．　３．５取样部位。本研究每次在果穗　北京农业大学学报，１９９３，１９（１）：　上取样的部位没有进行统一的规　４５—４７　定，同一穗花其花序不同部位上的　［９】张利，孟新法，张潞生，等．无　花蕾大小和花粉质量不同。同一穗　核葡萄胚发育及早期离体培养的研　花序其不同部位上胚的质量是否　究Ⅱ．无核葡萄胚发育的特点［Ｊ１．北京　有别，有待进一步的研究。　农业大学学报，１９９１，１７（４）：５５—５９　［１Ｏ】赵密珍，苏家乐，钱亚明，等．　参考文献　红宝石无核葡萄胚珠培养成苗技术　［１】王飞，王跃进，周建锡．无核葡萄　研究［Ｊ］．果树学报，２００５，２２（２）：１６６—　与中国野生葡萄杂种的胚挽救技术　１６８　研究［Ｊ】．园艺学报，２００６，３３（５）：１０７９—　［１１】李桂荣，王跃进，唐冬梅，等．　１０８２　无核白葡萄胚挽救育种技术研究［Ｊ１．　［２】Ｄ．Ｊ．Ｇｒａｙ，Ｌ．Ｃ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｊ．Ａ．　西北植物学报，２００１，２１（３）：４３２—　Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ．ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏ—　４３６　ｇｉｅｓ　ｆｏｒ　ｉｎ　Ｏｖｕｌｏ　ｅｍｂｒｙｏ　ｒｅｓｃｕｅ　ｏｆ　［１２】郭修武，郭印山，张海娥，等．　ｓｅｅｄｌｅｓ　ｇｒａｐｅｓ［Ｊ１．ＨｏｔＳｃｉｅｎｃｅ，１　９８７，　接种时期和培养基对无核葡萄胚挽　２２（６）：１３３４—１３３５　救的影响［Ｊ】．园艺学报，２００７，３４（２）：　【３】陈琳琳，王跃进，石艳，等．无核　３２９．３３２　葡萄胚挽救影响因素的研究［Ｊ】．西北　［１　３】Ｐ．Ｓｐｉｅｇｅｌ—Ｒｏｙ．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ　植物学报，２００７，２７（７）：１３１７—１３２２　ａｎｄ　ｐｌａｎｔ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｇｒａｐｅ　ｃｕｌｔｉ—　［４】刘小宁，王跃进，张剑侠，等．粉　ＶａｒＳ　ｗｉｔｈ　ａｂｏｒｔｉｖｅ　ｏｖｕｌｅｓ　ａｎｄ　ｓｅｅｄｓ［Ｊ］．　红无核葡萄胚珠、胚乳及胚发育与　Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．１９８５，１　１０（１）：　败育的研究［Ｊ１．西北植物学报，２００５，　１０９．１１２　５（１Ｏ）：１９４７—１９５３　［５】张宏明，孟新法，张潞生．无核葡　萄胚珠发育及早期离体培养的研究　Ｉ．激素对胚珠离体培养的影响［Ｊ１．北　京农业大学学报，１９９０，１６（３）：２７７—