遗传学论文

【摘要】原发性高血压发病的遗传因素，即家族关系已被多年医疗实践所证实。高血压

患者的家族倾向在生命早期已经建立，父母均患高血压，其子女发病率达46%；父母一方患高血压，子女发病率达28%；父母血压正常，子女发病率仅达3%。动物实验研究已成功地建立了遗传性高血压大鼠模型，繁殖几代后几乎100%发生高血压。随着人类基因组计划的完成，遗传基因的研究进入了后基因组时代。一个以定位、识别和克隆原发性高血压的易感基因为研究重点的高血压基因研究正在迅速发展。由于原发性高血压患者具有家族遗传的特性，并且发现母系遗传发生率高于父系遗传,人们逐渐开始关注线粒体基因在原发性高血压发病中的作用。线粒体DNA(mtDNA)具有母系遗传的特点,由mtDNA突变引起的家族性线粒体疾病常累及心、脑、骨骼肌等高能耗器官.近年来,研究者发现部分原发性高血压患者具有典型的母系遗传特点,从而证实并丰富了tRNAGln突变在母系遗传性高血压中的作用.本文综述了近年来对线粒体遗传与人类系统性高血压关系的遗传学研究进展，主要通过靶基因体外扩增后测序并进行病例对照研究、用差别杂交法(Differential hybridization)筛选正常人心脏cDNA文库的部分克隆，得到多个在自发性高血压鼠(SHR)心肌和高血压患者外周白细胞中高表达的线粒体基因。重组质粒，PCR-SSCP和测序，进行基因突变分析。最后经过统计学分析获得有统计学意义的结果。

【关键词】高血压 线粒体遗传 突变 母系遗传

1.前言自从1998年第一个疾病相关的线粒体突变位点被确认。迄今已经报道了近200个

与疾病相关的线粒体基因突变，其中绝大多数位于tRNA基因上虽然tRNA基因只构成整个线粒体基因组的10％，但这些基因却是研究线粒体基因突变与疾病发生关系的热点。线粒体tRNA基因突变与疾病关系是非常复杂的，单个线粒体tRNA基因突变可以产生不同的症状，而不同的基因突变又以引发同一种疾病。线粒体tRNA突变基因导致的疾病多与细胞的能量代谢障碍有关。近年来研究人员一直在研究线粒体tRNA突变基因型与表型之间的关系及其分子机制。很多文献归纳了tRNA循环周期过程中临床和分子生物学特征及其分子机制。线粒体tRNA突变后，氨基酰化特性和线粒体中氨基酰一tRNA的稳态水平、tRNA合成、结构、稳定性以及与翻译机器成分的相互作用都可能发生改变。然而，迄今为止，其详细机制还不清楚。

2.相关遗传学研究.

2.1直接基因测序的方法 采用直接基因测序的方法对原发性高血压患者线

粒体tRNAGln“的突变情况进行筛选，并对发生突变的患者的临床特征进行分析，面评估线粒体tRNAGln变化与原发性高血压的关系，探讨原发性高血压病患者母系遗传的遗传标志和临床特点。在哺乳动物细胞中，存在着两套蛋白质翻译系统：一套存在于细胞质中，负责细胞绝大多数蛋白

质的翻译；另一套则位于线粒体中，负责一部分线粒体蛋白质的翻译，两套翻译系统均有独

立的一套tRNA。线粒体tRNA基因全部是单拷贝基因，任何一个tRNA基因上的突变都将直接影响到线粒体翻译系统的稳定性，而且，不同于蛋白质基因可以通过密码子的摇摆性和i级结构上的代偿在一定程度上抵消单点突变的影响编码线粒体tRNA的基因上的任何一个点突变对线粒体活力都可能有致命影响。线粒体tRNA与人类疾病之间高度相关性，吸引了众多科学家的研究兴趣。尽管线粒体tRNA基因突变导致疾病的分子机理还不清楚，但越来越多的证据显示．致病性突变会对线粒体tRNA的结构和功能造成严重的破坏。系统地研究线粒体tRNA突变与疾病发生的关系，不但有助于帮助我们理解线粒体突变相关性疾病的发生机制，甚至可能帮助疾病的早期诊断、预防和治疗。线粒体基因突变与原发性高血压的研究是高血压研究领域的新焦点，最近Schwartz等。用全基因扫描的方法观察了20名患有原发性高血压的美国人的线粒体基因突变的情况，共发现了297个位点的改变，其中包括15个tRNA的的突变。本研究通过直接测序的方法在tRNA吲。上共发现了8个位点突变。与未发生tRNA突变的发性高血压患者相比，发生tRNA突变的原发性高血压患者的共同特征是高血压的发病时间明显提前。表明携带tRNA突变的患者在环境因素的刺激下更易于发生高血压。既往研究表明BMI与原发性高血压的早发现象相关，通过对比分析有、无线粒体tRNA突变的原发性高血压患者BMI是否存在差异，结果表明两组患者BMI不存在统计学差异，表明该研究中出现的原发性高血压早发现象与BMI无关。往研究已经证实血糖、血脂、Cr、BUN等生化指标的异常与原发性高血压的发生和发展密切相关。为明确线粒体tRNA突变是否会影响血糖、血脂、Cr、BUN等生化指标，我们又对发生和未发生tRNA突变的相关生化指标进行了对比分析。结果显示，发生tRNAGln突变的原发性高血压患者TC、LDL—C明水平显低于无突变组。而Cr、BUN水平明显高于无突变组患者。表明tRNAGln突变可能会影响原发性高血压患者胆固醇的代谢，其可能机制尚不清楚，需要进一步的研究。血电解质在原发性高血压的发生、发展过程中亦发挥重要的作用其中血钾、血钠和血镁的变化与原发性高血压的关系更为密切。本研究发现发生tRNAGln突变的原发性高血压患者血钾平均值均显著低于无突变组；发生tRNAGln突变的原发性高血压患者血钠、血镁低于无突变组动物实验和流行病学调查都已经证实，增加钾和镁的摄入能够有效的减低血压。我们推测tRNAGln突变对血钾、血镁浓度的下调作用，可能直接或间接的参与原发性高血压的发生和发展。该研究结果提示在治疗具有母系遗传特征的原发性高血压患者时应注意检测其血电解质的变化，当血电解质异常的时候，应及时调整电解质，以便更好的控制血压。国内外的研究发现，血细胞的变化与原发性高血压的发生和发展密切相关。本实验结果表明，发生tRNAGln突变的原发性高血压患者红细胞、血红蛋白、血小板均明显低于无突变组。红细胞是机体血液循环系统中最多的有形成分，具有携带氧气、通过对心脏超声结果的分析，发现tRNAGln突变对心脏的结构和功能影响不大。我们还对发生tRNAGln突变的原发性高血压患者家族遗传史进行了调查，并对部分患者的家系遗传情况做了系谱图分析。结果发现，多数发生tRNA突变的患者具有母系遗传史，并且符合线粒体遗传的特点。

2.2差别杂交法(Differential hybridization) 采用差别杂交法筛选正常人心脏

cDNA文库的部分克隆，得到多个在自发性高血压鼠(SHR)心肌和高血压患者外周白细胞中高表达的线粒体基因。重组质粒，PCR-SSCP和测序，进行基因突变分析。过去的10年人们已证实引起高血压有2类型基因。一类是编码酶、激素或底物的基因；另一类是涉及高血压的遗传病基因近年来又发现几种与高血压相关的新基因，如在肾近曲小管上的SA基因在血管平滑肌上的Gax基因和rHRG-1基因等。本研究发现线粒体基因在高血压心肌中高表达，包括细胞色素C氧化酶亚单位1基因和ATPase 6基因，ATP酶6基因在高血压鼠中的DNA构象改变以及碱基突变、编码氨基酸的改变均属首次发现。同时还发现高血压患者亦存在类似的改变，说明ATPase 6基因突变在高血压发病中可能起一定作用。 线粒体基因的高表达

发生在高血压之前还是之后，以及与心肌肥厚的关系是关键问题。从动物模型来看，SHR是一种遗传性高血压模型，是WKY的一种变异株，仔鼠可在出生后早期发生快速而严重的高血压，并且SHR鼠与同龄WKY鼠比在3周心肌肥厚即十分明显，3个月即可出现心肌僵硬(Stiffness)。由此看来是先由遗传性状的改变而后引起血压增高，可能包括ATPase 6基因和其它相关基因一起参与高血压发病的过程。本研究结果显示，ATPase 6基因在心肌线粒体中发生两处突变，即G8701A和A8708G，而在肝、脾线粒体中点突变只发生在G8701A位上，而8708位无碱基突变。心脏是高血压病的靶器官，而肝、脾非靶器官，因此8701突变可能是在高血压形成前就存在，而8708位突变可能是血压增高后的改变，从而推论ATPase 6基因在高血压病的改变具有因果两重性。因为选择的SHR和WKY年龄一致，排除了可能存在的不同年龄鼠线粒体之间的差异。有高血压家族史而本人血压正常的年轻人中，不少人左室肥厚，这提示心肌肥厚不一定是高血压动力增高的结果，而是原发性的改变，由此引起心肌收缩力改变，最终导致血压增高。心肌细胞是高度依赖线粒体能量供应的器官之一，ATPase 6基因又是编码ATP合成的ATP酶复合物的一部分，因此ATPase 6基因的突变引起编码氨基酸的变化，必然导致蛋白质结构的变化，进而影响ATP的合成。自发性高血压火鸡心室异肌浆蛋白ATPase活性低，ATP产率下降，ATP减少到不能维持心肌细胞的正常功能，可能是引发心肌肥厚的原因之一。有报道ATPase 6 T8993G突变引起ATP产量减少和引起ATPase结构的不稳定。因此据ATPase 6碱基突变分析，它可能是导致心肌肥厚原因，而高血压对心肌靶器官的影响引起ATPase 6碱基进一步突变，导致编码氨基酸和蛋白质结构及酶活性的进一步变化。基因突变可能是ATPase 6基因高表达的原因本研究发现ATPase 6基因在高血压心肌中高表达，进而比较高血压和正常心肌ATPase 6基因序列发现ATPase 6基因8701位碱基G(WKY)突变成A(SHR)(G8701A)，8708位碱基A突变成G(A8708G)。通过计算机分析，这2处突变均导致了编码氨基酸的改变，G8701A引起丙氨酸变成苏氨酸，A8708G使组氨酸变成精氨酸，两者均可引起ATPase蛋白的功能变化。高血压人中的类似改变，提示ATPase 6基因突变具有临床意义。 由于SHR与人类高血压有近似的发病机制，GenBank检测鼠、人线粒体基因同源性达70.4%，ATPase 6基因的同源性高达99%以上，如果此突变基因与高血压有关，则在高血压病人中也可能有此改变。白细胞DNA含有遗传的所有信息，大多数线粒体DNA点突变，都能从白细胞DNA中检出，因此可检测外周血白细胞。我们对临床确诊为高血压病、冠心病心肌梗塞及正常人各6例进行ATPase 6基因点突变的检测，发现4例高血压病的线粒体ATPase 6基因8584位碱基由G突变成A(G8584A)，编码20位氨基酸由丙氨酸变成苏氨酸；冠心病心肌梗塞8584位碱基无变化，1例8575位碱基由C变成T(C8575T)，但编码的氨基酸仍为亮氨酸，为同义突变。高血压病人ATPase 6基因在同一位点的相同突变很可能不是偶然的，它与高血压鼠中碱基突变和编码氨基酸的改变一致，提示这一突变很可能与高血压病有一定联系。由于采用直接测序方法，因此排除了PCR产生突变的可能性。由于线粒体基因具有一定特殊性，如因种族 、民族不同而有一些差异，随年龄增长基因缺失可能会增多。所以在选择临床病例时，就尽量考虑排除这些因素的影响，使不同组间具有可比性。线粒体基因突变可预示疾病的进展和恶化，突变的线粒体DNA达到一定程度能引起组织器官的功能异常，症状的严重性与突变的线粒体DNA含量和组织对线粒体ATP依赖程度有关。心肌对线粒体供给能量的依赖程度高，氧化磷酸化功能缺陷表现也明显。本研究4例G8584A突变的高血压患者中，都显示有左室肥厚的表现，3例有明确的家族史，母亲均为高血压病患者。鉴于正常人和冠心病患者都未出现8584位点的突变，以及有关文献报道在扩张性和肥厚性心肌病中无此突变发生，这一突变可能对高血压具有一定特异性。一些学者研究发现线粒体基因改变的区域与特定的心血管病有一定的对应关系。在临床高血压病人中发现ATPase 6基因的碱基突变和编码氨基酸的改变，可能提示其在高血压病的发生与发展中具有意义。

以上两项研究表明线粒体tRNA

Gln

突变可能会导致其结构和功能的变化，进而通过干扰血脂

代谢、破坏血电解质的平衡以及血细胞的稳态，参与原发性高血压的发生和发展。临床上部

Gln

分原发性高血压患者出现明显的母系遗传的特点，可能与线粒体tRNA突变有关。为以后

从线粒体基因水平寻找原发性高血压发生、发展的原因提供坚实的理论基础。

【参考文献】

1 Siebert PD, Chemchik A. Modified acid guanidinium thiocynate-phenol-chloroform

RNA extraction method which greatly reduces DNA contamination. Nucleic Acids Res,1993,21(8):2019

2 Hayashi K. PCR-SSCP：Asimple and sensitive method for detection of mutation in the genomic DNA. PCR Methods Appl,1991,1(1):34

3 Anderson S, Bankier A T, Barrell B G,et al. Sequence and organization of the human mitochondria. Nature,1981,9(290):457

4 Cruz Coke R. The genes of human hypertension. Rev Med Chil,1997,125(3):351 5 Yang T, Hassan S A, Singh I, et al. SA gene expression in the proximal tubule of normotensive and hypertensive rats. Hypertension,1996,27(3 part 2):541

6 Yamashita J, Itoh H, Ogawa Y, et al. Opposite regulation of Gax homeobox expression by Angiotensin Ⅱ and C type natriuretic peptide. Hypertension,1997,29(1 part 2):381 7 Chen G, Zhang C, Zhu Y. et al. Cloning and expression of a novel gene related to hypertension. Natl Med J China,1997,77(11):823

8 Houstek J, Klement P, Hermanska J,et al. Altered properties of mitochondrial ATP-synthase in patients with a T→G mutation in the ATPase 6(subunit a) gene at position 8993 of mtDNA. Biochim Biophys Acta,1995,1271(2～3)：349

9 Shoffner J M, Wallace D C. Mitochondrial genetics: Principles and practice. Am J Hum Genet,1993,51(6):1179

10 Holme E, Tulinius M H, Larsson N G,et al. Inheritance and expression of mitochondrial DNA point mutations. Biochim Biophys Acta,1995,1271(1):249 11 Delles C．Mitochondria．maternal transmission and hypertension[J]．J Hypertens，2007，25(10)：2001—2003．

12 Yang Q，Kim SK，Sun F，et a1．Matemal influence on blood pressure suggests involvement of mitochondrial DNA in the pathogenesis of hypertension：the Framingham Heart Study[J]．J Hypertens，2007，25(10)：2067—2073．

13 Dominiczak AF，Negrin DC，Clark JS，et a1．Genes and hypertension：from gene mapping in experimental models tovascular gene transfer strategies[J]．Hypertension，2000，35(1 Pt 2)：164—172．

14 Gharavi AG，Phillips RA，Finegood DT，et a1．Glycogen synthase polymorphism,insulin resistance and hypertension[J]．Blood Pressure。1996，5(2)：86·90． 15 Yang W，Huang J，Ge D，et a1．Lipoprotein lipase gene is in linkage with blood pressure phenotypes in Chinese pedigrees[J]．Human Genetics，2004。115(1)：8-12． 16 Motone M，Katsuya T，Ishikawa Ket a1．Associalion between hepatocyte growth factor gene polymorphism and essential hypertension[J]．Hypertens Res，2004，27(4)：247·25 17 Zhao W，Wang L，Lu X，et a1．A coding polymorphism of the kaUikrein 1 gene is associated with essential hypertension：a tagging SNP·based association study in a Chinese Han

population[J]．J Hypertens，2007，25(9)：1821-1827．

18 Geller DS．A mineralocorticoid receptor mutation causing human hypertension[J]．Curr Opin Nephrol Hypertens，2001，10(5)：661-665．

19 Devereux RB，Alonso DR,Lutas EM，et a／．Echocardiographic assessment of left ventricular hypertrophy：comparison to necropsy findings[J]．Am J Cardiol，1986，57(6)：450—458．

20 Zongbin Li，Yuqi Liu，Li Yang，et a1．Maternally inherited hypertension is associated with the mitochondrial tRNAa*A4295G mutation in a Chinese farnily[J1．Biochem Biophys Res Commun，2008。367(4)：906—9l 1．

21 Wittenhagen LM，KeUey SO．Dimerization of a pathogenic human mitochondrial tRNA[J]．Nat Struct Biol，2002，9(8)：586．590．

22 Wittenb．agen LM，Roy MD，KeUey SO．The pathogenic U3271C human mitochondrial tRNALeu(UUR)mutation disrupts a fragile anticodon stem[J]．Nucleic Acids Res。 2003，3l(2)：596—601．

23 Schwartz F，Duka A，Sun F，et a1．Mitochondrial genome mutations in hypertensive individuals[J]．Am J Hypertens，2004，17(7)：629—635．