p16基因高表达对细胞衰老的调控作用

学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：字●泰孕日期：≯Ｉ３年ｒ月、７日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州Ｉ大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州Ｉ大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影Ｆｐ、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州Ｉ大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位做作者：袅．１玲日期：矽ｆ≥年ｊ月摘要摘要衰老（ａｇｉｎｇｏｒｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）是机体的细胞、组织与器官在结构和功能上逐渐出现不可逆转地全面的退行性变化。对衰老原因和机理的研究目前尚没有完全统一的认识。但近期越来越多的研究表明细胞衰老是遗传上的程序化结果所致，细胞衰老过程受到某些基因控制。ｐ１６基因是细胞衰老过程中的关键效应物，在遗传控制程序中起主要作用。Ｐ１６蛋白是细胞周期有关的蛋白激酶４（ｃｙｃｌｉｎ．ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ４，ＣＤＫ４）的抑制因子，它通过ｐ１６．ｃｙｃｌｉｎＤ／ＣＤＫ．Ｒｂ途径来调控细胞周期，影响细胞的生物钟．细胞寿命和端粒长度，直接参与细胞增殖的负调节。近年来的研究发现ｐ１６基因在复制性衰老时多呈高表达，说明Ｐ１６在细胞衰老过程中起重要作用。本研究首先构建ｐ１６过表达载体，转染２９３细胞，通过检测ｐ１６高表达对细胞增殖及细胞周期的影响，采用ＲＴ－ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｗｉｎｇ以及Ｄ．半乳糖苷酶染色技术分析ｐ１６高表达对细胞衰老的调控作用。从而分析ｐ１６基因在细胞衰老过程中发挥调控作用。因此，本课题共分为两个部分，第一部分：ｐ１６过表达载体的构建；第二部分：ｐ１６基因高表达对细胞衰老的调控及研究机制。第一部分：通过合成带有限制性酶切位点（ＨｉｎｄｌＩＩ，ＫｐｎＩ）的ｐ１６引物，扩增ｐ１６基因全长ＯＲＦ序列，然后将其双酶切连接至ＰＥＧＦＰ－Ｎ１载体，通过转化、克隆挑选和测序鉴定，成功构建含有ｐ１６基因的重组载体ｐＥＧＦＰＮｌ．ｐ１６。第二部分在成功构建ｐ１６过表达载体的基础上，将过表达载体转染２９３细胞，并设正常组和转染空质粒组做对照。首先通过ＣＣＫ．８法和流式细胞术分别观察其对２９３细胞增殖和细胞周期的影响，结果发现ｐ１６过表达载体的转染抑制了２９３细胞的增殖和生长，并将细胞周期阻滞在Ｇ０／Ｇ１期；然后通过ＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测转染前后ｐ１６和衰老相关基因ｐ２１在基因水平和蛋白水平的表达变化。结果显示ｐ１６过表达可以上调细胞衰老相关标记基因ｐ２１的表达，说明ｐ１６可能通过促进ｐ２１的表达导致细胞衰老；最后，通过ｐ．半乳糖苷酶染色证实细胞衰老。总之，本实验成功构建ｐ１６过表达载体并将其转染至２９３细胞，通过多种细胞生物学和分子生物学实验检测ｐ１６过表达对细胞增殖、细胞周期以及细胞摘要衰老的影响，初步探讨ｐ１６过表达对细胞衰老的调控作用，并为进一步沉默ｐ１６的表达，探索延缓细胞和机体衰老的机制和方法提供理论依据。关键词：ｐ１６基因高表达；ｐ２１；细胞衰老；细胞增殖；细胞周期调控————————————————————一———————————————————————————————————一ＡｂｓｔｒａｃｔＡｂｓｔｒａｃｔＡｇｉｎｇｏｒｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｉｓａｎｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅｐｒｏｃｅｓｓｗｈｉｃｈｉｎｖｏｌｖｅｓｔｈｅｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｉｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｄｌａｌｌｇｅｓｏｆｃｅｌｌｓ，ｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｍｅｒｅｈａｖｅｂｅｅｎｎｏｏｒｇａｎｓａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｔｉｌｌｎｏｗ，ｏｆａｅｘａｃｔａｎｄｕｎｉｆｉｅｄｔｈｅｏｒｉｅｓａｂｏｕｔｔｈｅｒｅａｓｏｎｓａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅａ１ｓｓｔｕｄｉｅｓｈａｖｅｓｈｏｗｎｔｈａｔｃｅｌｌｕｌａｒａｇｉｎｇ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｍｏｒｅａｎｄｍｏｒｅｅｖｅｎｔ．ｗｈｉｃｈｉｓｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｂｙｓｏｍｅｇｅｎｅｓ·Ｐ１６ｉｓｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｅｆｆｅｃｔｏｒｇｅｎｅｗｈｉｃｈｐｌａｙｓＰ１６ｐｒｏｔｅｉｎｉｓａｎｋｅＹａｍａｊｏｒｒｏｌｅｉｎｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔｈｅｃｅｌｌａｇｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ·ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｔｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ４（ＣＤＫ４），ａｎｄｔｈｅｐ１６－ｃｙｃｌｉｎＤ／ＣＤＫ－ＲｂｐａｔｈｗａｙｓｔｏａｆｆｅｃｔｃｅＵｒｅｇｕｌａｒｅｓｔｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅｔｈｒｏｕｇｈｌｉｆｅａｎｄｔｅｌｏｍｅｒｅｌｅｎｇｔｈ．Ｔｈｉｓｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｓｐｌ６ｇｅｎｅＣａｎｔｈｅｃｅｌｌｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｉｓｐｒ０１ｉｆ．ｅｒａｔｉｏｎ．Ｒｅｃｅｎｔｓｔｕｄｉｅｓｈａｖｅｆｏｕｎｄｔｈａｔｐｌ６ｇｅｎｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅａｇｉｎｇ．ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｈｅｒｏｌｅｉｎｃｅｌｌｌ６ｐｌａｙｓｐｒｏｃｅｓｓ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈａｔｐａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔＴｈｅｒｅｆｏｒｅ．Ｗｅｆｉｒｓｔｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｖｅｃｔｏｒｐｌ６ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｏｎｉｔｉｎｔｏｔｈｅ２９３ｃｅｌｌｌｉｎｅ．Ｔｈｅｎ，ｗｅｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐｌ６ｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｃｅｌｌｃｙｃｌｅ，ａｎｄｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｔｈｅｃｅｌｌｃｅｌｌｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｌ６ｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｇｉｎｇｂｙＲＴ－ＰＣＲ，Ｗｅｓｔｅｒｎａｒｅｂｌｏｔｔｉｎｇａｎｄｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｓｔａｉｎｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｓｏ．ｔｈｅｒｅｔｗｏｐａｒｔｓｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ．Ｔｈｅｆｉｒｓｔｐａｒｔｉｓｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐｌ６ｔｈｅｅｆｆｅｃｔａｎｄｏｖｅ卜ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｅｔｏｒ，ａｎｄｔｈｅｓｅｃｏｎｄｐａｒｔｉｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰａｎｓｐｅｃｉｆｉｃｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｌ６ｈｉｇｈｃｅｌｌａｇｉｎｇ．ｅｎｔｉｒｅｈｕｍａｎｐｌ６ＯＲＦｗａｓｇｅｎｅｒａｔｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲｕｓｉｎｇｔｈｅｔｈｅｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｏｎｅ：Ｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓ（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｉｔｅ），ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｃｃｅｓｓｉｏｎａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｈｕｍａｎｐｌ６ＩＮＫ４／ＭＴＳ１ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋｎｕｍｂｅｒ：Ｕ２６７２７．１），ａｎｄｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄａｔｔｈｅＨｉｎｄＩＩＩａｎｄＫｐｎＩｓｉｔｅｓｏｆｐＥＧＦＰ－Ｎ１．Ａｔｌａｓｔ，ｗｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｈｅｐＥＧＦＰＮ１．ｐ１６ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｐａｎｔｗｏ：Ｂａｓｅｄｏｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｂｙｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ，ｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐｌ６ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ，ｗｅｔｒａｎｓｆ．ｅｃｔｅｄｉｔｉｎｔｏｔｈｅ２９３ｃｅｌｌｌｉｎｅ．Ｎｏｒｍａｌｕｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ２９３ｃｅｌｌｌｉｎｅａｎｄａｎｏｔｈｅｒａｓｇｒｏｕｐｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｅｍｐｔｙｐｌａｓｍｉｄｗｅｒｅｉｎｖｌｏｖｅｄｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｆｉｒｓｔｌｙ，ｗｅｄｅｔｅｃｔｅｄＡｂｓｔｒａｃｔ————————————————————————一—————————————————————————一＿ｔｈｅｅｔｉｅｃｔｏｆｐｌ６ｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＦｌｏｗｏｎＣＣＫ－８ａｎｄｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｃｅｌｌｃｙｃｌｅｂｙｃ饥ｏｍｅｔ珥Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｐ１６ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣａｎｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅ２９３ｏｆｉｎＧＯ／Ｇ１ｐｈａｓｅ·Ｔｈｅｎ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｌｏｎｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｒｒｅｓｔｔｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅｒｅｓｕｌｔｓＲＴ－ＰＣＲａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ·Ｔｈｅｐ１６ａｎｄｐ２１ｇｅｎｅｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｓｈｏｗｅｄｍａｔｐ１６ｏｖｅｒ．ｅＸｐｒｅｓｓｉｏｎｍａｔｐ１６Ｃａｎｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐ２１ｇｅｎｅ，ｓｕｇｇｅｇｈｎｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ·Ａｔｌａｓｔ，ｗｅｍａｙｂｅ雄．ｅｃｔ１ｔｈｅｃｅｌｌａｇｉｎｇｂｙｐｒｏｍｏｔｉｎｇｐ２ｓｔａｉｎｉｎｇ．ｃｏｎｆｉｒｍｅｄｍｅｔｒａＩｌｓｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｉｓａｇｉｎｇｂｙｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｍｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ｗｅｃｏｎｓｔｍｃｔｅｄｉｎｔｏ２９３ｃｅｌｌａｖｅｃｔｏｒｐ１６ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉ。ｎａｎｄｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｔｏｎｃｅｕｌｉｎｅ，锄ｄｔｈｅｎｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐ１６ＯＶｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｌｏｎａｎｄｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｃｅｌｌｃｙｃｌｅｂｉ０１０９ｙａｇｉｎｇｂｙａｖａｒｉｅｔｙｏｆｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇＹａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｅＸｐｅｒｉｍ啪．ＯｕｒｏｎｔｈｅｒｅｇＩｌｌａｔｌｏｎｏｆｐｌｂｒｅｓｕｌｔｓｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒｅｘｐｌｏｒｉｎｇｔｈｅｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｅｌｌａｇｉｎｇ，Ｏｉｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｍｅｔｈｏｄｓｄｅｌａｙｉｎｇｃｅｌｌａｇｉｎｇｂｙｓｉｌｅｎｃｉｎｇｐ１６ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ·６ｇｅｎｅ；ｐ２１；ｃｅｌｌａｇｉｎｇ；ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉ。ｎ；ｃｅｌｌＫｅｙｗ。ｒｄｓ：。ｖｅｒ－铱ｐｒｅｓｓｉ。ｎ。ｆｐ１ｃｙｃｌｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎＩＶ英文缩写ｃｄｃＣＤＫＣＫＩＲｂＨＥＫ２９３ＦＢＳＰＢＳＡＰＳＰＭＳＦＤＭＳＯＥＤＴＡＳＤＳＧＦＰ英文缩略表英文缩略表英文全称ｃｅｌｌｄｉｖｉｓｉｏｎｃｙｃｌｅＣｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅｓＣｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒＲｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａＨｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｋｉｄｎｅｙｃｅｌｌｓＦｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｌ，ｌｍＰｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓａｌｉｎｅＡｍｍｏｎｉｕｍｐｅｒｓｕｌｆａｔｅＰｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅＤｉｍｅｔｈｙｌＳｕｌｆｏｘｉｄｅＥｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄＳｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅＧｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎＶ中文名称细胞分裂周期基因周期蛋白依赖性蛋白激酶周期蛋白激酶抑制因子视网膜神经母细胞瘤蛋白人胚胎肾细胞胎牛血清磷酸盐缓冲液过硫酸铵苯甲基磺酰氟二甲基亚砜乙二胺四乙酸十二烷基硫酸钠绿色荧光蛋白目录目录摘要……………………………………………．．ＩＡｂｓｔｒａｃｔ………………………………………．．ＩＩ工英文缩略表………………………………………．．Ｖ引言……………………………………………．．９ｊｌ画……………………………………………··第一部分：ｐ１６过表达载体的构建………………………．３前言……………………………………………………３刖舌……………………………………………………３１材料与方法……………………………………………．３１．１材料．．…．．…．．…．…．．…．……．．．…．．…．…．．…．．…．…．３１．１。１菌种与质粒………………………………………………………………．３１．１．２细胞………………………………………………………………………．３１．１．３主要试剂及设备…………………………………………………………．．３１．２方法…．…．．……．．…．．…．．…．．…．…．．…．……．．．．．．．．．４１．２．１１．２．２ＲＮＡ提取…………………………………………………………………．．４ＰＣＲ引物设计……………………………………………………………．．４１．２．３重组载体的构建…………………………………………………………．．５２结果…………………………………………………．８２．１总ＲＮＡ提取结果．．．．．．．…，．…．．…．．．…．．…．…．…．．…．…．．８２．２ｐ１６０ＲＦ电泳结果．…．．．…．．…．．…＋．…．…．．…．……．．…．．．．９２．３目的片段和质粒双酶切后电泳图谱．…．．．．．．．…．．．．…．．…．．…．．．．９２．４重组质粒菌液ＰＣＲ鉴定结果……．．…．．．…．…．．…．…．．．．…．．．１０２．５重组质粒双酶切鉴定．．．…．…．．．…．．．．…．…．．…．…．．．…．．．１１２．６重组过表达质粒测序．．．…．．…．．…．……．…．．…．…．．…．．．．１１第二部分：ＰＩ６基因高表达对细胞衰老的调控及机制研究……．１４ＶＩ目录前言…………………………………………………．．１４刖吾…………………………………………………．．１４１材料与方法……………………………………………１５１．１材料…．…．．．．．．…．．．……．…．．．．．……．．．…．．…．．．…．．１５１．２方法…．…………………．．．……………．…．……．．…１７１．２．１脂质体转染………………………………………………………………１７１．２．２流式细胞术检测转染效率………………………………………………１８１．２．３ＣＣＫ一８法检测ｐｌ６对２９３细胞增殖的影响……………………………．１８ＲＴ—ＰＣＲ检测ｐｌ６和ｐ２１的表达………………………………………．１９ｆ｝－半乳糖苷酶染色……………………………………………………．２２１．２．４流式细胞术检测ｐ１６对２９３细胞周期的影响…………………………１８１．２．５１．２．６各组中ｐ１６和ｐ２１蛋白的表达…………………………………………２０１．２．７２实验结果……………………………………………．．２２２．１２．２２．３２．４２．５２．６ｐ１６过表达载体转染２９３细胞．……．…．…………………．．．．２２ｐ１６高表达对２９３细胞增殖的影响…．………………………．．２３ｐ１６高表达对２９３细胞周期的影响…．．．．………．…………．．．．２３ＲＴ—ＰＣＲ检测转染前后ｐｌ６。ｐ２１的表达．…．…．……．………．．．．２４ＷｅｓｔｅｒｎｂＩｏｔｉｎｇ检测转染前后ｐ１６，ｐ２１的表达……．．．．．．……．．２５ｐ一半乳糖苷酶染色…．．．．．．．．．．．．．．．…．．．………．．．．……．．．２５３讨论…………………………………………………２６４主要结论和进一步的研究设想……………………………．．２８４．１本研究的主要结果和结论．…．．．．……．．．……．．．．．………．．．．．２８４．２进一步研究设想……．……．．……．．……．．．．．…．．．．．…．．．．２８参考文献…………………………………………２９综述……………………………………………．３２ｐ１６信号通路与细胞衰老的研究进展……………………３２１２３ｐｌｐｌ６基因的发现与结构…………………………………．３２６基因的表达产物及功能……………．………………．．３２ｐ１６－ｃｙｃＩｊｎＤ／ＣＤＫ—Ｒｂ途径是调控细胞衰老的重要信号通路……．３３ＶＩＩ目录参考文献…………………………………………３５个人简历…………………………………………３７致谢……………………………………………．３８目录引言衰老（ａ西ｎｇｏｒｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）是机体的细胞、组织与器官在结构和功能上逐渐出现不可逆转地全面的退行性变化。自１９世纪末国内外应用实验方法研究衰老以来，对衰老机理先后提出的学说不下２０余种，然而很多学说并没有得到实验研究的支持。目前的研究认为，衰老是干细胞衰退、ＤＮＡ退化、饮食精神因素、衰老基因活跃等综合因素的结果，但仍未形成统一的衰老理论【卜３１。已有研究证明ｐ１６基因是细胞衰老的关键效应物，是遗传控制程序中的主要环节，它通过ｐ１６．ｃｙｃｌｉｎＤ／ＣＤＫ－－Ｒｂ途径调控细胞周期，影响细胞的生物钟．细胞寿命和端粒长度，而非激活端粒酶起作用【５＇６】。ｐ１６基因做为一种肿瘤抑制基因，直接参与细胞周期的调控，在细胞增殖中起到负调节作用【＿７１。ｐ１６基因位于人类第９号染色体断臂的２区１带，即９ｐ２１，由３个外显子和２个内含子组成，第１个外显子的长度是１２６ｂｐ，第２个外显子的长度是３０７ｂｐ，第３个外显子的长度是ｌｌｂｐ。ｐ１６的ｃＤＮＡ克隆总长度为９６０ｂｐ，其中含有单一的开放读码框架（ｏｐｅｎ组成。Ｐ１６蛋白定位于细胞核内，ＤａｖｉｄＢｅａｃｈ等（８】已经证明了Ｐ１６蛋白是在细胞分裂周期（ＣｅｌｌＤｉｖｉｓｉｏｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），长度为４４４ｂｐ，编码的Ｐ１６蛋白由１４８个氨基酸Ｃｙｃｌｅ）中起作用，参与抑制与细胞分裂周期有关的激酶（ＣＤＫ４）的活性。细胞周期调节是一个极为复杂的过程，近年来发现一类基因与细胞周期的调节密切相关，即细胞分裂周期基ｌ困（ｃｅｌｌｄｉｖｉｓｉｏｎｃｙｃｌｅ，ｃｄｃ基因），它们控制着细胞分裂的启动及各个时相的转换。Ｃｄｃ基因编码产物是蛋白激酶，参与调控细胞周期的Ｇ１期．Ｓ期，Ｇ２期．Ｍ期的关键点转换，周期蛋白和周期蛋白依赖性蛋白激酶结合为复合物在细胞分裂过程中起正向调节作用，参与Ｇ１．Ｓ期转换的调控。而ｐ１６蛋白会与周期蛋白竞争结合周期蛋白依赖性蛋白激酶，导致周期蛋白不能与周期蛋白依赖性蛋白激酶结合为复合物，从而抑制了细胞周期的正常进行【６】。一旦ｐ１６基因缺失或突变导致功能缺失，就不能抑制ＣＤＫ４，最终导致细胞无限增殖，加速肿瘤发生。总之，ｐ１６基因是一种非常重要的新的抗癌基因，一旦失活，则会引起细胞恶性增殖【９１。细胞衰老过程是借助于信号转导途径实现的【７１。其中视网膜神经母细胞瘤蛋ＩＸ引言白（Ｒｂ）在细胞衰老信号通路中起重要作用。研究发现在衰老细胞中，低磷酸化是Ｒｂ的主要形式。这可能与激酶活力降低有关。周期蛋白激酶（ＣＤＫ）在细胞增殖中有重要作用，它们的活性被周期蛋白激酶抑制因子（ＣＤＫｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＣＫＩ）所调控，周期蛋白激酶抑制因子（ＣＤＫｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＣⅪ）与细胞衰老相关。ＣＫｌ分为２个家族：第１个是ＩＮＫ４家族，第２个是Ｃｉｐ／Ｋｉｐ家族。ＩＮＫ４家族有４个成员：ｐ１６ＩＮＫ４ａ，ｐ１５ＩＮＫ４ｂ，ｐ１８ＩＮＫ４ｃ，ｐ１９ＩＮＫ４ｄ。ＩＮＫ４家族ＣＫＩ抑制ＣＤＫ４．６激酶，参与调控Ｒｂ的非磷酸化使其处于生长抑制状裂５１。Ｈａｒａ等【８】认为Ｉ№对ｐ１６蛋白有负反馈调节作用，最近发现ｐ１６蛋白能够促进磷酸化的Ｉ曲蛋白降解【２６】。在衰老细胞中，Ｒｂ仅以其低磷酸化的生长抑制状态存在。这是因为在衰老细胞中，ｐ１６ＩＮＫ４ａ处于高水平表达，随着细胞分裂次数的上升，ｐ１６ＩＮＫ４ａ表达逐渐上调。进一步的研究发现ｐ１６基因在复制性衰老时多呈高表达，说明ｐ１６基因与细胞衰老有关。本研究首先构建ｐ１６过表达载体，然后将过表达载体转染２９３细胞，使用ＣＣＫ．８法和流式细胞术观察细胞增殖和细胞周期的变化，以半定量ＰＣＲ检测ｐ１６和衰老相关基因ｐ２１的表达，以Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔｔｉｎｇ法检测ｐ１６及其ｐ２１的表达变化。并进一步通过ｐ．半乳糖苷酶染色实验检测ｐ１６高表达对细胞衰老的影响和调控。旨在探讨ｐ１６基因对细胞衰老的调控。为下一步沉默ｐ１６表达，延缓细胞和机体的衰老，延长机体寿命打卞基础。本论文共分为两个部分，第一部分：ｐ１６过表达载体的构建；第二部分：Ｐ１６基因高表达对细胞衰老的调控及研究机制。Ｐ１６过表达载体的构建第一部分：ｐ１６过表达载体的构建●。‘‘ｏｏ●一月ＩＪ吾近年来，随着对衰老的深入研究，目前认为衰老是一种与基因相关的疾病，已经发现某些基因与细胞衰老密切相关。已有研究证明ｐ１６基因是细胞衰老的关键效应物，是遗传控制程序中的主要环节，它通过ｐ１６．ｃｙｃｌｉｎＤ／ＣＤＫ—Ｒｂ途径调控细胞周期，影响细胞的生物钟．细胞寿命和端粒长度，而非激活端粒酶起作用。近年来发现ｐ１６基因在细胞衰老过程中起重要作用，在复制性衰老时多呈高表达［１２－１５］。而确定一个基因在细胞生命过程中的作用就是要分析该基因在其特定发育时空模式中所具有的独特功能。目前基因功能分析中所用的主要方法包括基因敲除、ＲＮＡ干扰、过表达、转基因、反义技术和显性负向突变策略。本实验使用的是过表达的方法，构建含有ｐ１６基因的重组载体ｐＥＧＦＰＮｌ．ｐ１６。然后将其转染至细胞，研究其高表达对细胞增殖和衰老的影响。所以，本文的第一部分就是构建ｐ１６过表达载体。１材料与方法１．１材料１．１．１菌种与质粒感受态细胞大肠杆菌ＤＨ５ａ，ＰＥＧＦＰ．Ｎ１质粒，该载体含卡那霉素抗性基因和ＧＦＰ荧光标记基因。１．１．２细胞２９３细胞为本实验室保存细胞，用含有ＩＯ％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２高糖培养基，在３７℃、５％Ｃ０２条件下培养，常规传代。在本实验用于总ＲＮＡ的提取，逆转录ｃＤＮＡ，作为扩增ｐ１６全序列的模板。１．１。３主要试剂及设备电热恒温鼓风干燥箱上海新苗医疗器械有限公司Ｐ１６过表达载体的构建胰酶细胞消化液恒温水浴锅４℃药名储藏柜Ｃ０２培养箱一８０℃低温冰箱移液枪质粒小提试剂盒ＰＣＲ仪百级超净工作台微量震荡仪江苏省碧云天生物技术研究所赛默飞世尔仪器有限公司上海新苗医疗器械有限公司赛默飞世尔仪器有限公司赛默飞世尔仪器有限公司百得移液器天驰生物技术有限公司ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ赛默飞世尔仪器有限公司赛默飞世尔仪器有限公司１．２方法１．２．１ＲＮＡ提取本实验采用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取细胞中总的ＲＮＡ，操作步骤严格按照说明书的要求，具体如下：（１）将细胞消化后离心，转移至１．５ｍｌＥｐ管。ｆ２）每管加ｌｍｌＴｒｉｚｏｌ吹打均匀，室温放置５ｍｉｎ。（３）分别加０．２ｍｌ氯仿（每１ｍｌＴｒｉｚ０１），振荡１５ｓ，４０Ｃ１２０００ｒｐｍ离心１５ｍｉｎ。（４）此时液体分三层，下层红相、中层有机相、上层无色相，将上层无色相小心转移于一干净的１．５ｍｌＥｐ管中。（５）加入等体积预冷的异丙醇，室温放置１０ｍｉｎ使ＲＮＡ析出，４＂Ｃ１２０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ。（此时可在管底看到沉淀）（６）小心去除上清液，加ｌｍｌ７５％乙醇，涡旋，４０Ｃ７５００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ。（７）弃上清，使乙醇挥发晾干，加入２０或２５ｕｌ无酶水。测Ａ２６０／Ａ２８０（正常１．８＿２．１）及浓度。（８）．８０℃保存。注：操作过程中避免ＲＮＡ酶的干扰，以防降解。１．２．２ＰＣＲ引物设计根据Ｈｕｍａｎｐｌ６ＩＮＫ４／ＭＴＳｌｍＲＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为：Ｕ２６７２７．１）Ｐｒｉｍｅｒ５．０设计引物上游５＇－ＧＣＣＧＧ△△鱼￡！！ＡＴＧＧＴＧＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴＴＧＧＴ－３’４Ｐ１６过表达载体的构建和下游５’．ＣＴＡＡＴ鱼鲤△￡￡ＣＡＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＧＧＧＣＡＧＡ．３’（下划线表示引入的酶切位点，酶切位点分别是ＨｉｎｄＩＩＩ，ＫｐｎＩ），以人总ＲＮＡ为模板扩增ｐ１６开放阅读区的全序列，共４２１ｂｐ。（引物由上海生物工程有限公司合成）表１－１扩增人ｐ１６基因ＯＲＦ序列的特异引物引物名称ｐ１６０ＲＦ—ｓＰ１６０ＲＦ．ａＳ引物序列（５＇－３’）酶切位点ＨｉｎｄｌＩＩＫｐｎＩ５＇－ＧＣＣＧＧ丛Ｑ￡ⅡＡＴＧＧＴＧＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴＦＧＧＴ－３’５ｔ．ＣＴＡＡＴ鱼鲮△￡￡ＣＡＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＧＧＧＣＡＧＡ－３’注：下划线碱基表示引物设计时引入的酶切位点１．２．３重组载体的构建１．２．３．１总ＲＮＡ的提取取对数期生长的２９３细胞，消化后离心，收集细胞。本实验采用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取细胞中总的ＲＮＡ，操作步骤见１．２．１。１．２．３．２ＲＴ－ＰＣＲ扩增目的基因Ａ、逆转录（１）去除基因组ＤＮＡ试剂５ｇＤＮＡＥｒａｓｅｒＢｕｆｆｅｒｇＤＮＡＥｒａｓｅｒＲＮＡＲＮａｓｅ—ｆｒｅｅｄｄＨ２０使用量２ｐＬ１ｐＬｌｕｌ加至总体积ｌＯ此将这１０ｕｌ体系：４２。Ｃ２ｍｉｎ室温５ｍｉｎ。（２）配制逆转录反应混合液，ＲＴ反转录合成ｃＤＮＡ，试剂５×ＢｕｆｆｅｒＰｒｉｍｅｒＭｉｘＥｎｚｙｍｅｍｉｘ使用量４ｕｌｌｕｌ１ｕ１１０ｕｌＵｐｔｏ２０ｕｌ＠ＲＮＡｄＨ２０按照反应条件在ＰＣＲ仪上进行反转录反应合成ｃＤＮＡ（此条件可以依据实际Ｐ１６过表达载体的构建情况优化）：３７。Ｃ，２０ｍｉｎ（反转录反应）；８５。Ｃ，５Ｓ（反转录酶的失活反应）。分装后一２０℃保存备用。Ｂ、以新合成的ｃＤＮＡ为模板合成ｐ１６０ＲＦ目的片段，ＰＣＲ反应条件为：９５℃，５ｍｉｒａ９５。Ｃ，３０ｓ；６３。Ｃ，３０ｓ，７２。Ｃ，３０ｓ，共３５个循环；７２℃，５ｍｉｎ，４。Ｃ保存。反应体系如下：５×ＰｒｉｍｅＳ揪ｒＭｄＮＴＰＢｕｆｆｅｒ１０ｐＬ５ｇＬ１ｇＬ１０９Ｍｐ１６０ＲＦ—Ｓ１０１ａＭｐ１６０ＲＦ－ａｓＰｒｉｍｅＳＴＡＲｒＭＨＳＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅｅＤＮＡｄｄＨｚＯ１此１ｇＬ５ｇＬＵｐｔｏ５０９ＬＰＣＲ产物经１．５％的琼脂糖凝胶电泳分离，然后在凝胶成像系统中快速的将目的片段割胶回收，胶回收使用的是上海生工的胶回收试剂盒，纯化回收得到ｐ１６０ＲＦ片段。１．２．３．３双酶切反应将纯化的ｐ１６０ＲＦ片段和ｐＥＧＦＰ．Ｎ１载体分别使用相应的限制性内切酶在３７℃水浴中进行双酶切，反应时间约为６小时。双酶切反应体系如下：双酶切结束之后，酶切产物经１．５％的琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外照射中６Ｐ１６过表达载体的构建快速的将目的片段割胶回收，然后使用上海生工的胶回收试剂盒纯化回收的目的片段。１．２．３．４连接和转化将双酶切完全的ｐ１６０ＲＦ片段和ｐＥＧＦＰ－Ｎ１载体进行连接。连接所使用的连接试剂盒为ＴａＫａＲａ公司的ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ２．０。连接反应总体积为１０此，反应体系为：ＬｉｇａｔｉｏｎＳｏｌｕｔｉｏｎＩ５此，ＨｉｎｄｌＩＩ和ＫｐｎＩ处理过的Ｐ１６０ＲＦ２ｐ．Ｌ，ＨｉｎｄｌＩＩ和ＫｐｎＩ处理过的ＰＥＧＦＰ－Ｎ１３此，混合均匀，１６℃连接过夜。然后按照下面转化的方法将连接产物转化到ＤＨ５ａ感受态细胞中。连接产物１０Ｉ－ｔｌ转化感受态细胞大肠杆菌ＤＨ５ａ的操作步骤：（１）将已连接好的反应液ｌＯｕｌ，加入装有５０ｕｌＥ．Ｃｏｌｉ感受态细胞管中，轻轻混匀，冰上放置３０ｍｉｎ。（注：感受态细胞很脆弱，取的过程要迅速放冰上。）（２）迅速置于４２９Ｃ水浴锅水浴９０ｓ后，迅速放入冰水中处理５ｍｉｎ。（３）每管加入７００ｕｌ不含任何抗性的液体ＬＢ培养基，２５０ｒｐｍ、３７。Ｃ培养ｌｈ，稍微离心弃掉６００ｕｌ上清，吹匀后将剩余１００ｕｌ菌液全部涂布在已倒好的加有卡那霉素的琼脂板上。（４）３７。Ｃ正置培养１ｈ，再倒置培养过夜（１２．１６ｈ），第二天挑菌。１．２．３。５重组载体的鉴定在测序之前可通过菌液ＦＣＲ鉴定转化是否成功。菌液ＰＣＲ的反应体系与扩增ｐ１６０ＲＦ的反应体系相同，以菌液做模板，使用ｐ１６上下游引物各１ｕ１，（ＰＣＲ参数：９４。Ｃ５ｍｉｎ；９４。Ｃ３０ｓ，６９。Ｃ３０ｓ，７２。Ｃ３０ｓ，３５ｃｙｃｌｅｓ；７２。Ｃ５ｍｉｎ），对质粒转化做鉴定。ＰＣＲ产物经１．５％琼脂糖胶电泳检测后，将阳性克隆送生工测序。取ｌｍｌ菌液，分４００ｕｌ于１．５ｍｌＥＰ管中送上海生物公司测序，另６００ｕｌ加３０％的甘油保种放置于．８０℃冰箱，备用。１．２．３．６质粒的提取在超净台，将保种的１００ｕｌ菌液加１００ｍｌＬＢ液体培养基（Ｋａｎ＋）加到锥形瓶中，２００ｒｐｍ、３７℃摇床过夜。第二天用ＯＭＥＧＡ公司的Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．⑧Ｅｎｄｏ．ＦｒｅｅＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉＫｉｔ提取用于注射的无内毒素质粒。（１）取１００．２００ｍｌ菌液用５０ｍｌ离心管４５００ｒｐｍ室温离心８ｍｉｎ，收集菌体沉淀。Ｐ１６过表达载体的构建（２）去上清，加ｌＯｍｌＳｏｌｕｔｉｏｎＩ／ＲＮａｓｅＡ，涡旋或用枪吹打重悬菌体。（３）加１０ｍｌＳｏｌＩＩ，来回颠倒１５次轻柔混匀，得到澄清裂解液。（４）加５ｍｌｌｃｅｄＢｕｆｆｅｒＮ３，颠倒几次至出现白絮沉淀，室温２－３ｍｉｎ。（５）准备结合柱－－ａｎ５ｍｌＢｕｆｆｅｒＧＰＳ至结合柱中，室温放置３．１０ｍｉｎ，４５００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，弃滤液，将柱子插入５０ｍｌ收集管中。（６）将第（４）步获得的溶液及沉淀全部转移至针筒式过滤器中，室温放置２ｍｉｎ后推压过滤器，用一个新的５０ｍｌ离心管收集滤出的清液。此步可用“１５０００ｒｐｍ４。Ｃ离心１０ｍｉｎ得上清”代替。（７）第６步获得清液后，加入０．１体积４。Ｃ放置的ＥＴＲＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ，混匀７．１０次。冰上１０—２０ｒａｉｎ，４２℃水浴５ｍｉｎ，４５００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ（去ＥＴＲ）．加入０．５无水乙醇，２ｍｉｎ。（８）结合质粒一把准备好的结合柱插入５０ｍｌ收集管，小心转移混合液至结合柱里，４５００ｒｐｍ３．５ｍｉｎ，弃滤液。（９）重复第８步，至所有上清都过滤完，弃清液。ｆｌＯ）Ｊ；Ｈ１０ｍｌＢｕｆｆｅｒＥＨＢ到结合柱上，４５００ｒｐｍ，离心３ｍｉｎ。（１１）力１１１０ｍｌＤＮＡＷａｓｈＢｕｌｙｅｒ到结合柱，４５００ｒｐｍ，离心３ｍｉｎ。（１２）空转一把空柱子套回离心管，最大转速不超６０００ｒｐｍ，离心１０—１５ｍｉｎ，干燥柱子。（１３）进一步干燥柱子一把柱子转移真空抽滤装置上抽滤１０ｍｉｎ，或把柱子放６５。Ｃ恒温箱１０．１５ｍｉｎ。ｆ１４）把结合柱套在一个新的５０ｍｌ离心管中，加入１．３ｍｌＥｎｄｏｔｏｘｉｎＦｒｅｅＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（５０。Ｃ预热洗脱液效果更好）室温放置２－５ｍｉｎ，最高转速离心洗脱质粒ＤＮＡ３ｍｉｎ。（１５）用分光光度计测量提的质粒ＤＮＡ的浓度。２结果２．１总ＲＮＡ提取结果ＲＮＡ提取结束之后取ｌｕｌＲＮＡ产物经１．５％琼脂糖凝胶电泳分离（如图１．１），结果显示有清晰的三条带，分别为２８Ｓ、１８Ｓ、５ｓ，而且２８Ｓ条带的亮度约为１８ＳＰ１６过表达载体的构建的两倍，说明提取的总ＲＮＡ十分完好。紫外分光光度计测定Ａ２６０／Ａ２８０ｂＬ值为１．９７，ＲＮＡ浓度为５０５ｎｇ／ｕｌ，说明提取的ＩⅢＡ不存在ＤＮＡ污染和蛋白质污染，ＲＮＡ浓度合适且纯度较好，可以用于下一步实验分析。１２３２８５１８５５５图１．１ＲＮＡ电泳结果２．２ｐ１６０ＲＦ电泳结果以人。营，ＲＮＡ为模板，用含有ＨｉｎｄｌＩＩ和ＫｐｎｌＴ２酶切位点的ｐ１６ａＪＩ物扩增人ｐ１６的ＯＲＦ序列。由于目的片段在胶回收纯化过程中有损失，本实验ＰＣＲ时做了５０ｕｌ体系，以获得足够量的目的片段。ＰＣＲ结束之后产物经１．５％琼脂糖凝胶电泳分离，结果发现在４００．５００ｂｐ之间出现很亮条带（如图１．２），由于ｐ１６０ＲＦ片段为４２１ｂｐ，此结果说明我们设计的引物特异性非常高，ｐ１６０ＲＦ序列扩增成功。ＭＰ１６ｂｐｂｐｂｐｂＤｂｐ图１．２１９１６全序列的合成２．３目的片段和质粒双酶切后电泳图谱目的片段和空质粒经ＨｉｎｄｌＩＩ和ＫｐｎＩ于３７℃水浴中双酶ｔ刃６－８ｈ（６０９ｌ体ｔ系：Ｈｉｎｄ３：３９ｌ，ＫｐｎＩ：３９ｌ，１０ｘＭｂｕｆｆｅｒ：６９ｌ，ＤＮＡ：３０ｕ１），然后将酶切产物经１．５％９Ｐ１６过表达载体的构建琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果（图１．３）。电泳图谱显示ｐ１６在４００ｂｐ．５００ｂｐ之间出现明亮的单一条带，而ＰＥＧＦＰ．Ｎ１表现也为单一条带。由于质粒ＤＮＡ通常情况下以超螺旋、开环或线性形式存在，而我们采用碱裂解法提取的质粒以超螺旋结构为主（开环次之，线性的最少），所以电泳表现为２．３条带。但是酶切之后质粒ＤＮＡ则全部变为线性结构，所以电泳显示只有一条带。因此，电泳结果说Ｉｔ韭Ｊｐｌ６０ＲＦ和空载体ＰＥＧＦＰ．Ｎ１已经被酶切完全。骐ｐ｛６镑渤毒蹴３渤：潮｛∞酶图１．３目的片段ｐ１６和质粒ＰＥＧＦＰ—Ｎ１双酶切结果２．４重组质粒菌液ＰＣＲ鉴定结果双酶切之后的目的片段和空质粒连接转化大肠杆菌ＤＨ５ａ后涂板，阳性克隆挑菌后菌液ＰＣＲ，（具体操作步骤同前面），共做了１５个样，１．５％琼脂糖凝胶电泳结果显示（如图１．４），第３、５、６、７、１１、１４泳道在４００ｂｐ．５００ｂｐ２＿ｆ司出现对应条带。说明第３、５、６、７、１１、１４泳道目的片段有可能已正确插入载体ＰＥＧＦＰ．Ｎ１，对应的菌液做进一步进行测序鉴定。＾，｛３５６７１１１４５００ｂｐ３００。０ｂｂｐｐ２００ｂｐ１００ｂＯ图１．４菌液ＰＥＲ后１．５％琼脂糖凝胶电泳结果１０Ｐ１６过表达载体的构建２．５重组质粒双酶切鉴定重组质粒小提之后，可对重组质粒经ＨｉｎｄｌＩＩ和ＫｐｎＩ双酶切，１．５％琼脂糖凝胶电泳结果（图１．５），最左边点Ｍａｒｋｅｒ，１泳道上样为空质粒，空质粒以超螺旋、开环或线性形式存在，电泳之后会出现三条带。２泳道上样为双酶切过的重组质粒，如果目的片段成功的连接入载体，那么双酶切之后应该得到相应的目的片段和线性的载体片段。电泳结果显示在４００．５００ｂｐ之间有一条明显的条带，即为目的片段，而上面的大片段即为切开的质粒条带。这一结果说明重组质粒中己插入目的片段ｐ１６０ＲＦ。Ｍ１２．一ｐｌ６图１．５重组过表达质粒双酶切电泳图（１为空质粒，２为酶切后的重组质粒，最左边是ＤＮＡＭａｒｋｋｅｒ）２．６重组过表达质粒测序双酶切鉴定法可以初步的鉴定是否将目的片段连接入载体中。但是为了更准确确保过表达载体ＰＥＧＦＰ．Ｐ１６．Ｎ１构建成功，插入的片段连接正确，没有基因突变，可进一步选择阳性的重组质粒送生工测序。然后将人ｐ１６０ＲＦ原序列和ＰＥＧＦＰＮｌ．Ｐ１６测序结果用ｉｅｌｌｙｆｉｓｈ软件比对，结果完全一致（黄色标注部分），没有碱基突变或移码，翻译氨基酸也完全相同说明过表达载体ｐＥＧＦＰＮｌ．Ｐ１６构建成功（图１．６）。Ｐ１６过表达载体的构建人ｐ１６０１砸Ｇ嘶酶ｒ再妊，磷、一ｊ立＾一＂譬．¨祛，ｉ。？¨●：ｊ誓？：≯、一＿≯ｔ、Ｆ”．。叠霄？‘ｊｊ：４矗，ｊ蹦７ＴＴＣ：ｊ钙ｊｊ？“１＾６测——。一。囊“硝，７＋ｊｒ。≯，。＿＂．ｊｉ＿寥¨一．“”¨＝一。。ｌ一《：≯”ａａ＝ｃｔｔａｔｇｇｔｇｃｇｃａｇ出ｔｏｔｔｇＥｔＥ州ｃｔｃｃｇｇ“ｔｃｇ＃ｃｇｃｇｃ乱ｇｃｇｇｃｃｃＥｃｃｇｃｇｉｇｔｇｑｇ乱ｔｔｔｃ乱ｇｇｔｔｃ哪ＣｏⅢⅢｓ６测ｔｃａｃｇｇｇｇｇａｇｔｇｇｇｃ９５ｃｇ㈨ｇｇｇｇｃｇ㈣ｇｃ。ｇｃｔｇｔｇｇｃｃｅｔｃｇｔｇｃｔｇａｔｇｃｔａｃｔｇ＾ｇｇａｇｃｅａｇｃｇｔｃｔａｇｇｇｃ丝！：！！兰！型！垫！兰！ｃ：ｉ“？ｒ＃：ｉｉ叠ｉ以，ｉ二．ｈ、订，Ｈ：ｉ‘。。ｚ：：、瓣：、，、。、砧。？ｊ：÷÷ｊ＊一：。？ｔＦ’’ｊ：¨？ＡＴｚ≯’≮≈王＝蠹珏，。人ｐ１６０礤＊，＝∥“＾ｊ？…ｊｉ．ｚＢ测臂？ｊ或ｉ：０７７ＭｉＣｔ－。ｉ？？疆茁ｆ’越嚣麓，谴？ｏ：：７ｔ。ｒ’ｐｚ强，一¨Ｉ？奠ｉｊ·矗？＾ｃ瓮Ｔ蚶瓤瓮？＿虻：＾弦？口辨’ｉ人ｐ１６０疆越一越。文矗ｃ？？ｚ戈ｉｉ祛？ｃ：二ｊ筒Ａｃｉ戈甜÷河：ｉ二。娃、≮ｔ。：：：？ｒ’瓤Ｋ＾ｆ誓Ｔ：譬辩ｚｊ瓮Ａ＿：、？ｏｚ：：氓地；ｘＰＥＧＦＰＮＩ—Ｐ１６测！“：一“ｏ。ｔ二＿一。～．“．．。…～尘：：：＿二：：兰二兰！＿＝二：兰。．竺：兰：二：竺二二羔三二：．：：！二三：：．兰兰：兰！！二塑竺ｃｇｇｃｔｇｇａｅｇｔｇｃｇｃ‘｜ｔｇｃｃｔｇｇ“ｃｃｎｃｔ‘ｃｃｃ乱‘ｇ州ｔ‘ｅｃｔ‘‘醇ｔｃｏ图１．６ＰＥＧＦＰＮｌ－Ｐ１６测序结果与ｐ１６０ＲＦ原序列比对图３讨论和小结ｐ１６基因是一种抑癌基因，是细胞衰老的关键效应物，它在复制性衰老时多呈高表达。研究还发现其表达产物直接参与细胞周期的调节，是细胞周期重要的负调节因子【ｌ６’２０１。随着研究的深入，Ｐ１６与细胞衰老关系的研究也成为生物学研究的热点。为研究ｐ１６在细胞中的功能，本实验使用的过表达的方法检测ｐ１６高表达对细胞衰老的影响。因此需首先构建ｐ１６过表达载体。ｐ１６全序列合成时，为避免在ＰＣＲ扩增过程中引入的偶然突变，本实验在扩增ｐ１６０ＲＦ序列时选择的是Ｔ水ａＲａ公司扩增效率高，保真性能强Ｉ钓ＩＤＮＡ聚合酶（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ），该酶能够大大降低延伸时间，提高扩增的能力，使其能够在更短的时间里扩增更长的ＤＮＡ片段，这样为保证实验准确性，实验的稳定性打下基础。另外，由于电泳分离、酶切、胶回收和纯化过程中都不可避免的会有一部分目的片段损失，因此为了获得足够数量的目的片段，本实验在ＰＣＲ时采用的是５０ｕｌ的反应体系，以期酶切后能够回收得到尽可能多的目的片段。同时，目的片段胶回收和纯目的片段胶回收和纯化过程中，要尽可能减少ＤＮＡ的损耗，质粒小提最后加水溶解ＤＮＡ，可先将无酶水在５０．６０度水浴锅预热，更有助于洗脱回收柱上的ＤＮＡ，提高回收率，最大限度的降低目的片段的损耗。另一方面，构建过表达载体过程中载体的选择非常重要，本实验选用ＰＥＧＦＰ．Ｎ１做为载体，首先该载体含有ＧＦＰ荧光蛋白，转染细胞之后便于观察，Ｐ１６过表达载体的构建载体与目的片段要连在一起，构成过表达载体，就要确保目的片段和载体含有相同的酶切位点。本研究ｑｂｐｌ６和ＰＥＧＦＰ．Ｎ１相同的酶切位点是ＨｉｎｄｌＩＩ和ＫｐｎＩ，值得注意的是要保ｉ，ＪＥｐｌ６的开放阅读区内不含这两种酶，避免目的基因被切开。而转化过程中，本实验选择大肠杆菌ＤＨ５ａ作为感受态细胞，转化效率高，感受态细胞较为敏感，操作时一定要按照说明书，阳性单克隆的挑选，要保证载体构建的成功，除了双酶切提取质粒之外，并送测序，并用序列比对软件比对，已确保载体构建完全成功。根据本课题组的前期研究经验，本实验通过合成含有双酶切位，点的ｐ１６全序列，含有双酶切位点的目的片段和载体双酶切之后连接转化感受态细胞，阳性克隆的挑选，质粒小提，测序，从而成功合成ｐ１６过表达载体。测序结果用ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ软件比对，合成的ｐ１６过表达载体序列与原序列完全匹配，结果表明载体构建成功，适用于后续实验。总之，该部分实验为后续研究奠定了坚实的细胞基础。Ｐ１６基因高表达对细胞衰老的调控及机制研究第二部分：Ｐｌ６基因高表达对细胞衰老的调控及机制研究●。‘－‘－·‘一月Ｕ吾研究表明，细胞衰老是遗传上的程序化结果，是受某些基因控制的，例如ｐ１６基因，ｐ２１基因，ｐ１９基因，ｐ５３基因掣２１。２６１。Ｈａｎ等【２７】在人类成纤维细胞中发现，ｐ１６能增加ｐ２１蛋白的稳定性，而ｐ２１贝０通过转录因子Ｓｐｌｊ而激活ｐ１６基因表达，二者协同抑制细胞周期。细胞周期的停滞是细胞衰老的前提，细胞衰老伴随着细胞形态的改变和相关基因表达的变化，已有研究表明，ｐ１６，ｐ２１或ｐ５３的增加己足以引起细胞衰老。Ｐ１６基因是细胞周期中的一种基本基因，其表达产物直接参于细胞增殖的负调节，Ｐ１６基因编码产物是１６ＫＤ的蛋白，Ｐ１６蛋白是作用于细胞分裂周期（ＣｅｌｌＤｉｖｉｓｉｏｎＣｙｃｌｅ）关键酶之一的ＣＤＫ４的抑制因子。近年来发现它在细胞衰老过程中起重要作用，它在复制性衰老时多呈高表达。ｐ１６ＩＮＫ４ａ／Ｒｂ是细胞衰老的重要通路，细胞衰老过程是借助于信号转导途径实现的。其中，视网膜神经母细胞瘤蛋白Ｒｂ在细胞衰老信号通路中起重要作用。视网膜神经母细胞瘤蛋白（Ｒｂ）通过自身磷酸化和非磷酸化在细胞周期中发挥调控作用，低磷酸化或者是未磷酸化状态Ｒｂ可与转录因子结合，从而抑制转录因子的转录激活功能，对细胞周期进行负调控，Ｒｂ的活力受到磷酸化／脱磷酸化的控制。在细胞周期的初始阶段，Ｒｂ没有被磷酸化；在Ｇ１、Ｓ、Ｇ２期和Ｍ期，大多数Ｒｂ已经被磷酸化。在Ｇｌ期，Ｒｂ在细胞周期发挥调控作用是通过细胞周期蛋白激酶（ＣＤＫ）来调控Ｒｂ的磷酸化来实现的，从而在细胞周期发挥调控作用。Ｒｂ在细胞周期早期的磷酸化由ＣＤＫ４／６与ＣｙｃｌｉｎＤ复合物来负责，ｐ１６蛋白和周期蛋白竞争结合周期蛋白依赖性蛋白激酶，导致周期蛋白不能与周期蛋白依赖性激酶结合为复合物，周期蛋白依赖性蛋白激酶不能被激活，从而Ｒｂ不能被磷酸化，低磷酸化Ｒｂ不能释放Ｅ２Ｆ转录因子，转录过程不能正常进行，细胞周期停滞。本研究在成功构建ｐ１６过表达载体的基础上，将过表达载体转染２９３细胞，并设正常对照组和阴性对照组，通过ＣＣＫ－８法和流式细胞术分别观察其对２９３细胞增殖和细胞周期的影响，进一步通过ＲＴ．ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测转染前后ｐ１６年Ｈｐ２１Ｅ２６－２７］在基因水平和蛋白水平的表达。１４Ｐ１６基因高表达对细胞衰老的调控及机制研究１材料与方法１．１材料２９３细胞为本实验室储备的细胞。１．１．１主要试剂及设备试剂及设备ＣＣＫ．８试剂盒哺乳动物蛋白抽提试剂兔抗人ｐ２１多克隆抗体兔抗人ｐ１６多克隆抗体鼠抗１３－ａｃｔｉｎ单克隆抗体辣根过氧化酶标记山羊抗小鼠二抗辣根过氧化酶标记山羊抗兔二抗，高灵敏度化学发光检测试剂盒苯甲基磺酰氟ＰＭＳＦ甘油北京康为世纪生物技术有限公司北京康为世纪生物科技有限公司北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司来源江苏省碧云天生物技术研究所北京康为世纪生物科技有限公司北京博奥森生物技术有限公司北京博奥森生物技术有限公司北京康为世纪生物科技有限公司北京康为世纪生物科技有限公司过硫酸铵ＡＰ脱脂奶粉蓝色预染中分量蛋白Ｍａｒｋｅｒ显影液和定影液多功能酶标仪（ＳＪ．８型）流式细胞仪（ＢＤ垂直板电泳槽半干转膜仪水平摇床微波炉雪花制冰机（ＳＩＭ．Ｆ１２４型）４。Ｃ低温离心机Ｃａｎｔｏ北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司美国ＢＤ北京康为世纪生物科技有限公司，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司上海圣荷西医疗用品有限公司美国ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ公司北京六一仪器厂美国伯乐Ｂｉｏ．Ｒａｄ北京六一仪器厂顺德市格兰仕电器实业有限公司日本三洋郑州大学一附院重点实验室提供ＩＩ型）Ｐ１６基因高表达对细胞衰老的调控及机制研究柯达胶片和暗盒ＰＶＤＦ膜９６孔培养板６孔培养板１５ｍＬ塑料离心管５０ｍＬ塑料离心管１．１．２主要试剂的配制北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司ＭＩＬＬＩＰＯＲＥＣｏｓｔａｒＵＳ．ＡＣｏｓｔａｒＵＳ．ＡＣｏｍｉｎｇＣｏｍｉｎｇ（１）１０ｍｍｏｌ／ＬＰＭＳＦ：称取０．０８７９ＰＭＳＦ粉末，加入５０ｍＬ异丙醇溶解，一般置于．２０℃保存。ＰＭＳＦ有剧毒，配制时要带手套和口罩，操作一定要小心。（２）１０％ＳＤＳ：准确称取ｌｇＳＤＳ，溶解于９ｍＬ的双蒸水中，５０。Ｃ水浴使其溶解，最后用双蒸水定容至１０ｍＬ，放置室温保存。（３）１０％过硫酸胺（ＡＰ）：称取０．２９ＡＰ粉末，溶解于２ｍＬ双蒸水中，搅拌溶解后置于４℃短期保存。（４）１．５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ’ＨＣＩ（ｐＨ８．８）－称取１１．３６９的Ｔｒｉｓ粉剂（ＭＷｌ２１．１４），溶解于５００ｍＬ双蒸水中，完全溶解后用浓盐酸调ｐＨ至８．８，最后用双蒸水定容至６２．５ｍＬ，放置室温下保存。（５）１．０ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ‘ＨＣＩ（ｐＨ６．８）－称取７．５７９的Ｔｒｉｓ粉剂（ＭＷｌ２１．１４），溶解于５０ｍＬ双蒸水中，完全溶解后用浓盐酸调ｐＨ至６．８，最后用双蒸水定容至６２．５ｍＬ，室温下保存。（６）３０％Ａｃｒ／Ｂｉｃ：称取Ｏ．５９甲叉双丙烯酰胺（Ｂｉｃ）和１４．５９丙烯酰胺（Ａｃｒ），溶于５０ｍＬ双蒸水中，４。Ｃ避光保存，使用时恢复至室温即可。（７）２０％Ｔｗｅｅｎ２０：量取１０ｍＬＴｗｅｅｎ２０，用双蒸水定容至５０ｍＬ，混匀后，４＂Ｃ保存。（８）Ｏ．１５ｍｏｌ／ＬＮａＣＩ：称取０．４３８５９ＮａＣｌ（ＭＷ５８．４４），溶解于双蒸水中至５０ｍＬ，高温灭菌后室温下保存。（９）１００ｍｇ／ｍＬＢＳＡ：称取０．２９牛血清白蛋白（ＢＳＡ），溶解于２ｍＬ０．１５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌＢＳＡ饱和溶液中，置于．２０。Ｃ保存。绘制蛋白浓度标准曲线时，将１００ｍｇ／ｍＬ用Ｏ．１５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ稀释１００倍制成浓度为ｌｍｇ／ｍＬ蛋白标准品。（１０）还原型５ｘＳＤＳ上样缓冲液：将２．５ｍＬ１．０ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ·ＨＣｌ（ｐＨ６．８），０７８９二硫苏糖醇（ＤＴＴ），１．０９十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ），０．０５９溴酚蓝，２５ｍＬ甘油，１６Ｐ１６基因高表达对细胞衰老的调控及机制研究加入双蒸水溶解后，定容至１０ｍＬ，分装于１．５ｍＬＥＰ管中每份ｌｍＬ，４０Ｃ保存。（１１）电泳缓冲液：称取ｌｇＳＤＳ，１８．７７９甘氨酸（ＭＷ７５．０７），３．０３９Ｔｒｉｓ（ＭＷｌ２１．１４），用双蒸水定容至１Ｌ后，室温保存，溶液可重复使用。（１２）膜转移缓冲液：５．８９＂Ｉｒｉｓ（ＭＷ１２１．１４），０．３７９ＳＤＳ，２．９９甘氨酸（ＭＷ７５．０７），２００ｍＬ甲醇，溶解于１Ｌ双蒸水后室温保存，溶液可重复使用３～５次。（１３）ＴＢＳ缓冲液：将８．８９ＮａＣｌ和１０ｍＬ定容至１Ｌ，室温保存。１．１．３细胞的复苏和培养从液氮罐中快速的取出冻存的２９３细胞，用镊子夹紧冻存管的顶部放３７ｏＣｌｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ·ＨＣｌ０Ｈ７．５）溶解于蒸馏水中，水浴锅中并快速摇动，当细胞冻存液已经大部分溶化后，用７５％酒精棉球擦拭冻存管外壁，在超净工作台中然后立刻将细胞冻存液移入细胞接种入７５ｍｌ培养瓶中，加入１０ｍｌ含有１０％ＦＢＳ的高糖培养基，然后将细胞培养瓶置于３７ｏＣ、饱和湿度、体积分数为５％的Ｃ０２培养箱中卧式培养，在培养箱中旋开一点瓶口，使细胞通气，２４ｈ后观察细胞的贴壁情况及形态，并进行首次全量换液，弃去未贴壁的状态不好的细胞。定期观察细胞形态与数量变化。正常情况下细胞贴壁生长良好，平均２～３ｄ传代一次。选择处于对数生长期的细胞备用。１．２方法１．２．１脂质体转染用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００转染试剂盒转染细胞，操作步骤严格按照说明书的要求，以２４孔板为例，具体如下：（１）转染前一天，用５００ｕｌ的无抗生素的正常培养基接种Ｏ．５．２ｘ１０５的细胞，第二天当细胞达到７０％的汇合进行转染。（２）对要转染的样品，进行如下操作：ａ：在ＥＰ管中分别加入５０ｕｌ无血清无抗生素的培养基和０．８ｕｇＤＮＡ，轻柔混匀，制成ＤＮＡ稀释液。ｂ：在另一个ＥＰ管中，分别加入５０ｕｌ无血清无抗生素的培养基和２ｕｌＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００轻柔混匀，室温静止５ｍｉｎ。１７Ｐ１６基因高表达对细胞衰老的调控及机制研究Ｃ：将ＤＮＡ稀释液和Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００稀释液轻柔混匀，室温静止２０ｍｉｎ，形成ＤＮＡ—Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００复合物。（３）ＤＮＡ．Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００复合物加到要转染的细胞中，特别注意的是，要一滴一滴的加复合物，边加边轻轻摇动。（４）３７℃培养箱培养４．６ｈ后，更换含有血清的正常培养基，继续培养１８．４８ｈ。本实验待培养的２９３细胞达到７０％融合时，取３瓶７５ｍｌ正常培养的２９３细胞，分别作为正常组，转染空质粒组，转染ｐ１６过表达载体组，ＤＮＡ与转染试剂ｌｉｐ２０００的比例是８ｕｇ：２０ｕｌ。向转染培养瓶中加入配好的ＤＮＡ与转染试剂ｌｉｐ２０００的混合液，轻轻晃动瓶子，使混匀。另一瓶正常培养的细胞做对照，３７。Ｃ，５％Ｃ０２饱和湿度培养箱中培养，４８小时之后再荧光显微镜下观察ＧＦＰ表达。１．２．２流式细胞术检测转染效率（１）分别收集正常组，转染空质粒组，转染ｐ１６过表达载体组的细胞，１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。（２）加入２－３ｍｌＰＢＳ清洗２遍，离心弃去ＰＢＳ。（３）加入适量ＰＢＳ重悬细胞，调整细胞浓度为ｌｘｌ０６／ｍｌ，转入ＦＣＭ测试管上机测试。１．２．３ＣＣＫ－８法检测ｐｌ６对２９３细胞增殖的影响转染本实验采用ＣＣＫ一８法检测ｐ１６对２９３细胞增殖的影响。方法如下：２４小时后，接种于９６孔培养板，每孔等量接种１００ｕｌ细胞悬液（约２５００个／孔），每组设３个复孔。接种后２４ｈ采用ＣＣＫ．８法检测，每天同一时间加入１０ｕｌＣＫＫ．８溶液，于细胞培养箱中继续培养２ｈ，检测细胞在Ａ４５０ｎｍ波长下的吸光值，实验重复３次，以正常生长的２９３细胞为对照组计算细胞增殖率。连续测五天，记录数据，绘制柱状图。１．２．４流式细胞术检测ｐ１６对２９３细胞周期的影响采用流式细胞术检测ｐ１６转染之后对２９３细胞周期的影响，具体操作如下：（１）收集（２．５）×１０６／ｍ１的细胞总数，１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。（２）加入２－３ｍｌＰＢＳ清洗２遍，离心弃去ＰＢＳ，加入Ｏ．５ｍｌ的ＰＢＳ重悬细胞。（３）加入２ｍｌ７０％的冰乙醇（用之前在．２０度预冷）固定，放于４度冰箱过夜。Ｐ１６基因高表达对细胞衰老的调控及机制研究（４）第二天，１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ弃去冰乙醇。（５）加入３ｍｌ的ＰＢＳ洗２遍，１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ弃去ＰＢＳ。（６）加入０．５ｍｌＰＢＳ重悬细胞，静置。（７）加入２．５ｕｌ浓度为１０ｕｇ／ｕｌＲＮＡ酶，震荡混匀。（８）放入３７度水浴锅３０ｍｉｎ，迅速置于冰上冷却１５ｍｉｎ，终止ＲＮＡ酶的作用。（９）避光加入ＰＩ终浓度为５０ｕｇ／ｍｌ，即加入１００ｕｇ／ｍｌ的Ｐ１５００ｕｌ。（Ｉｏ）放于４度冰箱，避光保存不少于３０ｍｉｎ，转入ＦＣＭ测试管上机测试。（１Ｄ上机测试时，ＰＩ用氟离子激发荧光，激发光波长是４８８ｎｍ，发射光波长大于６２０ｎｍ。１．２．５ＲＴ－ＰＣＲ检测ｐｌ６和ｐ２１的表达ＲＴ．ＰＣＲ检测正常组，转染空质粒组，转染ｐ１６过表达载体组的２９３细胞中的ｐ１６和衰老相关基因Ｐ２１的表达，ＧＡＰＤＨ作为内参。２．１．ＰＣＲ反应体系如下表：试剂上下游引物ｃＤＮＡ相应的引物序列见表使用量各ｌｇＬ２ｕｌ１０ｕｌｕｐｔｏ２０ｕｌＭｉＸｄＨ２０ＰＣＲ反应条件为：９５。Ｃ，５ｍｉｎ；９５。Ｃ，３０ｓ；６３。Ｃ，３０ｓ，共３５个循环；７２。Ｃ，５ｍｉｎ，４。Ｃ保存。表１．２引物名称Ｆ增Ｈｕｍａｎｐｌ６，ｐ２１，Ｇ＿ＰＤ腱因序列特异性引物引物序列（５’一３’）片段大小退火温度５５℃Ｈｕｍａｎｐｌ６－ｓＨｕｍａｎｐｌ６－ａｓＨｕｍａｎｐ２１－ＳＨｕｍａｎｐ２１一ａＳＨｕｍａｎＧＡＰＤＨ．ｓＨｕｍａｎＧＡＰＤＨ．ｎｓＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＣＧＣＴＧＧＴＧＧＧＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＧＡＣＣｌｖｒＴＧＴＣＣＧＴＣＡＧＡＡＣＣＣＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＧＴＡＧＡＧＣＴｒＧＧＧＧＡＧＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＣＧＡＧＧＧＧＣＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＣＴＩ’ＣＴ２３ｌｂｐ５３℃２１９ｂｐ６３℃】９７ｂｐＰ１６基因高表达对细胞衰老的调控及机制研究１．２．６各组中ｐｌ６和ｐ２１蛋白的表达１．２．６．１细胞内总蛋白的提取（１）分别将正常组，转染空质粒组，转染ｐ１６过表达载体组２９３细胞消化，１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。（２）用２．３ｍ１ＰＢＳ漂洗两遍，１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，加入适量蛋白抽提试剂（２×１０６个细胞加２００ｕｌ的抽提试剂），冰上孵育２０ｍｉｎ，让细胞充分裂解。（３）１４０００ｒ／ｍｉｎ离心５—１０ｍｉｎ。（４）转移上清液至新的离心管中，并用考马斯亮蓝标准曲线法测蛋白浓度。（５）各管加入５×溴酚蓝溶液（上清液与５×溴酚蓝溶液的比例一４：１），在水浴锅上煮１０ｍｉｎ。即可放入。２０℃冰箱。１．２．６．２蛋白质的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳Ａ凝胶的制备１０ｍｌ１２％分离胶的配制：３．３ｍｌ４．０ｍｌ２．５ｍｌ０．１ｍ１０．１ｍｌ０．００４ｍｌ去离子水３０％聚丙烯酰胺溶液１．５ＭＴｒｉｓ－ＣＩ（ＰＨ＝８．８）１０％ＳＤＳ１０％ＡＰＳＴＥＭＥＤ４ｍｌ５％浓缩胶的配制：２．７ｍｌ０．６７ｍ１０．５ｍｌ０．０４ｍｌ０．０４ｍ１０．００４ｍｌ去离子水３０％聚丙烯酰胺溶液１．ＯＭＴｒｉｓ－ＣＩ（ＰＨ＝６．８、１０％ＳＤＳ１０％ＡＰＳＴＥＭＥＤＢ灌胶和电泳（１）取出长短不一的两块玻璃板，用自来水洗净，再用蒸馏水冲洗一次，３７。Ｃ烘干。（２）玻璃板封闭好以确保不漏胶。（３）分离胶的制备：根据所需分离胶浓度取上述各种试剂，摇动溶液混匀，将凝Ｐ１６基因高表达对细胞衰老的调控及机制研究胶溶液注入两层玻板中，不要产生气泡，持续注入至液面距梳齿２．３厘米处，在液面上注入一层水封闭。以隔绝空气，室温放置２５ｍｉｎ．３５ｍｉｎ，直至凝胶形成。（４）浓缩胶的制备：待分离胶完全聚合，轻轻倒掉上层液体，并用滤纸吸尽残液。混匀浓缩胶，在分离胶上面用枪慢慢注入浓缩胶液至玻板顶端，然后插入梳子，室温下聚合２５ｍｉｎ。（５）浓缩胶完全聚合后，轻轻取下梳子，电泳缓冲液洗涤加样槽除去聚合的丙烯酰胺：凝胶板安置于电泳槽，在内外槽均注入电泳缓冲液。（６）按２０ｕｌ／每空样量点样。９０Ｖ，３０ｍｉｎ，下层胶１００Ｖ，９０ｍｉｎ。（７）结束后，取出凝胶夹层，放在吸水滤纸上，用尺子掀起上面的玻璃平板，暴露凝胶板，用刀片切下所要蛋白大小的胶。１．２．６．３蛋白质转膜（１）切下所需蛋白大小的胶后，用剪刀剪下比胶稍微小点的滤纸片，比胶稍微大点的ＰＶＤＦ膜，制作由３层滤纸一分离胶一ＰＶＤＦ膜一３层滤纸组成的“夹心饼”结构。（２）放到转膜仪内，加入转膜液。（３）接通电源，时间２０ｍｉｎ，转膜电压为２０ｖ。１．２．６．４膜的封闭及抗体结合（１）转膜结束后取出ＰＶＤＦ膜，用镊子轻轻夹其放入平皿中，加入５％脱脂奶粉封闭液，水平摇床上轻轻摇动，室温封闭ｌｈ。（２）加入相应量一抗（用５％脱脂奶粉稀释），水平摇床上缓慢摇晃ｌｈ，放入４。Ｃ冰箱过夜。（３）第二天取出ＰＶＤＦ膜，放到干净的培养皿内，加适量ＴＢＳＴ，在水平摇床上摇晃洗涤１０ｍｉｎ后更换ＴＢＳＴ，洗膜３次：（４）加入用５％脱脂奶粉稀释的二抗稀释液，室温孵育ｌｈ，加适量ＴＢＳＴ，每次１０ｒａｉｎ，洗３次。１．２．６．５显色在暗室内用吸水纸将ＰＶＤＦ膜擦干，ＥｃＬ液中浸泡显色，然后用吸水纸擦干ＰＶＤＦ膜上的ＥＣＬ液，将膜放置在暗盒内，再放入ｘ胶片曝光。取出胶片，放入自动显影机冲洗，晾干后用扫描仪扫描结果。Ｐ１６基因高表达对细胞衰老的调控及机制研究１．２．７Ｂ一半乳糖苷酶染色将正常组，转染空质粒组，转染ｐ１６过表达载体组细胞分别铺于六孔板，检测ｐ一半乳糖苷酶的表达。（１）吸取细胞培养液，加入ｌｍｌＪｊ半乳糖苷酶染色固定液，室温固定１０ｍｉｎ。（２）吸除细胞固定液，用ＰＢＳ洗涤细胞３次，每次３ｍｉｎ。（３）吸除ＰＢＳ，每孔加入ｌｍｌ染色工作液。染色工作液的配置：Ｂ半乳糖苷酶染色液Ａ１０ｍｕｌ，ｐ半乳糖苷酶染色液Ｂ９３０ｕｌ，Ｘ．Ｇａｌ溶液５０ｕ１）（４）３７度孵育２０ｍｉｎ至２个小时，或者更长时间，直至部分细胞的颜色变蓝。（５）普通光学显微镜下观察。１０ｍｕｌ，ｐ半乳糖苷酶染色液Ｃ２实验结果２．１ｐｌ６过表达载体转染２９３细胞于６孔板铺板２９３细胞，待细胞达到７０％融合时进行脂质体转染。本实验分为三组，分别为正常组，转染空质粒组和转染过表达载体ＰＥＧＦＰＮｌ一Ｐ１６０ＲＦ组。转染４８小时后ＧＦＰ的表达量达到最高，于此时在荧光显微镜下观察ＧＦＰ的表达并检测转染效果。结果显示，空质粒组和过表达载体组都能明显观察到有ＧＦＰ的表达，而且转染空质粒组的荧光强度高于转染过表达载体组。这是因为空质粒转染效率比较高，所以在荧光显微镜下其ＧＦＰ较过表达组亮（如图２．１）。图２．１空质粒和重组质粒转染２９３细胞（２０×）ＧＦＰ观察（Ａ图为正常组，Ｂ图为空质粒转染２９３细胞４８小时，Ｃ图为过表达载体转染２９３细胞４８小时）然后，收集三组２９３细胞，用流式细胞术检测其转染效率（如图２．２），结果显示，相比较正常组，转染过表达载体组２９３细胞的转染效率为３５．１％，转染效率达到５０．５％。质粒转染效率比较高，这可能与ｐ１６高表达抑制了细胞的增Ｐ１６基因高表达对细胞衰老的调控及机制研究殖有关。，；‘。ｉ飞ｉ留２．２奠…。．，。……，。，，。…。，’；≥藏蠹藜》誓簿淤“““薹『『：纛。。……。。黧？“冀≮、一ｉ…、……。二二’，正常组转染空质粒组转染过表达载体组图２．２正常组，转染空质粒组，转染过表达载体组２９３细胞转染效率ｐｌ６高表达对２９３细胞增殖的影响正常组，转染空质粒组，转染过表达载体组的２９３细胞，用ＣＣＫ．８法检测其增殖情况，以时间为Ｘ轴，吸光值为Ｙ轴绘制２９３细胞的生长曲线。如图２．３所示，２９３传代培养１～２ｄ为迟缓期，细胞增殖较慢；传代培养２～５ｄ为对数生长期，细胞增长迅速；传代培养６￣７ｄ为平台稳定期，细胞的增长速度逐渐下降，增殖减慢。由正常组，转染空质粒组，转染过表达载体组２９３细胞生长曲线可知，转染过表达载体组，转染空质粒组细胞的增殖速度比正常组的细胞明显下降，转染空质粒组细胞的增殖速度比正常组的细胞增值速度慢，说明转染试剂对细胞造成伤害，细胞增殖缓慢。转染两天之后，过表达载体组增殖速度明显下降，说明ｐ１６过表达能够影响２９３细胞的增殖。１ＯＯ８＋正常组ｔ转染芏质链组士转染过表达载悻强０６单ＱｏＯ４０２０Ｏ０１２Ｊ４３６／培葬天数图２．３正常组，转染空质粒组，转染过表达载体组２９３细胞的增殖情况。２．３ｐ１６高表达对２９３细胞周期的影响对正常组，转染空质粒组，转染过表达载体组２９３细胞正常培养４８ｈ后，消化收集细胞进行固定染色，流式细胞仪检测２９３细胞的周期情况。结果发现，与正常组相比，转染空质粒组、转染过表达载体组２９３细胞在Ｇ０／Ｇ１期的百分Ｐ１６基因高表达对细胞衰老的调控及机制研究比由５９．２５％分别增加至６２．２５％和７１．１７％；同时伴随着Ｓ期百分比的减少。即在这个过程中，Ｇ０／Ｇ１期的百分比逐渐上升，而Ｓ期的百分比逐渐下降。这个过程中Ｇ２／Ｍ期百分比变化较小，可以粗略不计（图２．４）。该结果说明ｐ１６过表达载体的转染能够抑制２９３细胞的生长，并将细胞周期阻滞在Ｇ０／Ｇ１期。Ａ８耱缝遥魏德终豳隧捌蝴确蕊鲻馘图２．４２．４Ａ图ｐ１６对２９３细胞周期的影响Ｂ图统计学分析结果。ＲＴ—ＰＣＲ检测转染前后ｐｌ６，ｐ２１的表达提取正常组，转染空质粒组，转染过表达载体组２９３细胞的总ＲＮＡ，分别逆转录，ＲＴ．ＰＣＲ检测不同组中ｐ１６，ｐ２１的表达，ＧＡＰＤＨ作为内参。电泳结果显示（图２．５）ｔ常组与转染空质粒组的ｐ１６表达变化不明显，转染过表达载体组中ｐ１６的表达明显上升；另一方面，正常组与转染空质粒组中ｐ２１表达变化不明显，而转染过表达载体组中ｐ２１表达明显上升，这一结果说明ｐ１６转染成功，另外ｐ１６过表达导致细胞中与衰老相关的标记基因ｐ２１表达明显上升，也就是说ｐ１６的表达与细胞衰老呈现正相关。堕旦鱼图２．５正常组，转染空质粒组，转染过表达载体组２９３细胞中ｐ１６，ｐ２１的表达（１为正常组，２为转染空质粒组，３为转染过表达载体组；Ｍ为ＤＮＡＭａｒｋｅｒ，Ｇ为ＧＡＰＤＨ）２４Ｐ１６基因高表达对细胞衰老的调控及机制研究２．５ＷｅｓｔｅｒｎｂＩｏｔｎｇ检测转染前后ｐ１６，ｐ２１的表达通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ检测正常组，转染空质粒组，转染过表达载体组２９３细胞中ｐ１６，ｐ２１的蛋白表达情况，１３－ａｃｔｉｎ作为内参。结果显示正常组，转染空质粒组中ｐ１６和ｐ２１的蛋白表达变化不明显，而转染过表达载体组ｐ１６和ｐ２１的蛋白表达量明显上升（如图２．６）。这些结果表明ｐ１６过表达载体的转染，导致了２９３细胞中ｐ１６高表达，说明转染成功。另一方面转染ｐ１６过表达载体可以上调细胞衰老相关标记基因ｐ２１的表达，说明ｐ１６可能通过促进ｐ２１的表达导致细胞衰老。Ａｎ移；秀淄｛溯－慧；ＩＩ辫：ｉ∥酶燃女？髅黛一瓣蹴释必释甜曝嫩毋，鬓霪ｌ黎霞愿鬻溪ｐ’麓麟蠢雾栽蠢一一一鬻一甜扣ｌ＿厨ｌ豢ｙ鬈￥图２．６Ａ图为２９３细胞中Ｂ—ａｃｔｉｎ，ｐ１６，１９２１的蛋白表达情况（图中１为正常组，２为转染空质粒组，３为转染过表达载体组）。Ｂ图为ｐ１６，ｐ２１的蛋白表达的灰度值分析图。２．６Ｂ一半乳糖苷酶染色正常组，转染空质粒组，转染过表达载体组的２９３细胞转染２４小时之后，按照碧云天的ｐ．半乳糖苷酶染色试剂盒染色中操作步骤进行染色，１２．１８小时之后用普通显微镜观察Ｄ．半乳糖苷酶的染色情况。如果细胞被染色，说明细胞中有与衰老相关的１３．半乳糖苷酶的表达。该实验中转染过表达载体组在显微镜下明显看到细胞变蓝色的部分，蓝色的部分就是该组细胞中表达１３半乳糖营酶被Ｂ一半乳糖苷酶染色剂所染色，但是细胞状态不好，出现细胞碎片，细胞脱落，这说明转染试剂Ｌｉｐ２０００对细胞伤害很大，而正常培养的细胞和转染空质粒组的２９３细胞均无细胞变蓝，正常组状态较好，培养界面也很清晰，转染空质粒组细胞状态较正常培养组差，说明了ｐ１６过表达载体的转染，引起细胞的提前衰老，Ｐ１６基因高表达对细胞衰老的调控及机制研究ｐ．半乳糖苷酶的表达显著上升（如图２．７）。图２．７正常组，转染空质粒组，转染过表达载体组的２９３细胞中１３一半乳糖苷酶的着色情况（Ａ组为正常培养２９３细胞４０Ｘ：Ｂ为转染空质粒组２９３细胞４０×：Ｃ组转染的过表达载体组２９３细胞）３讨论Ｈａｎ等【２７】在人类成纤维细胞中发现，ｐ１６能增加ｐ２１蛋白的稳定性，ｐ２１则通过转录因子Ｓｐｌ而激活ｐ１６的基因表达，协同抑制细胞周期。细胞周期的停滞是细胞衰老的前提，细胞衰老伴随着细胞形态的改变和相关基因表达的变化［３４－４１】，已有研究表明，ｐ１６，ｐ２１，或ｐ５３的增加己足以引起细胞衰老。本实验选择２９３细胞（人肾上皮细胞系）作为转染细胞，相比较本实验室前期实验选择的间充质干细胞，其具有很高的转染效率，给本实验提供极大方便。在本实验过程中选用脂质体转染的方法。脂质体（ＬＲ）试剂是阳离子脂质体ＤＯＴＭＡ和ＤＯＰＥ的混合物（１：１）。它适用于把ＤＮＡ转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高５．１００倍，能把ＤＮＡ和ＲＮＡ转染到各种细胞。有研究表明利用脂质体介导ｐ１６ｃＤＮＡ真核表达质粒载体转入ｐ１６阴性的人红白血病细胞株（Ｋ５６２），发现细胞增值受到抑制，细胞凋亡速率增加。本实验中转染后通过ＣＫＫ－８检测细胞增殖，流式细胞术测细胞周期，转染前后，细胞周期发生明显变化，ｐ１６基因在一定程度上抑制了细胞增殖，细胞周期在一定程度上被阻遏。另一方面，通过ＲＴ．ＰＣＲ和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ检测了转染各组中ｐ１６和与衰老相关的标记基因ｐ２１的表达变化。结果显示，转染过表达组的２９３Ｐ１６基因高表达对细胞衰老的调控及机制研究细胞中ｐ２１表达有所上升，说明ｐ１６可以促进ｐ２１的表达，继而在细胞衰老过程中发挥作用。还有报导称腺病毒介导ｐ１６基因导入神经胶质瘤细胞后，ｐ１６蛋白和周期蛋白（ｃｙｃｌｉｎＤ）竞争结合周期蛋白依赖性蛋白激酶（ＣＤＫ），导致周期蛋白（ｃｙｃｌｉｎＤ）不能与周期蛋白依赖性激酶（ＣＤＫ）结合为复合物，从而阻止Ｒｂ蛋白磷酸化，细胞周期停滞于Ｇ１晚期，细胞增殖受到抑制。而本实验运用细胞生物学技术检测ｐ１６高表达对细胞增殖及细胞周期的影响，通过分子生物学实验（ＲＴ．ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ以及Ｄ．半乳糖苷酶染色）检测ｐ１６高表达对细胞衰老的调控所得的实验结果与报道相符和。细胞衰老的显著指标，除了ｐ２１表达明显升高，目前已有研究【２９】发现体外培养人二倍体成纤维细胞在ｐＨ为６时，其Ｄ．半乳糖苷酶染色的阳性率随代龄增加而增加【３１－３３１，他们把这种中性ｐ．半乳糖苷酶定义为衰老相关的ｐ．半乳糖苷酶（ＳＡ．ｐ．ｇａｌ）。因此Ｄ．半乳糖苷酶是目前公认的检测细胞衰老的金标准【４２４６】。本实验中Ｐ１６过表达载体转入２９３细胞，与正常组，转染空质粒组相比，衰老相关ｐ．半乳糖苷酶的表达量明显增多，与报道相符合。通过Ｂ．半乳糖苷酶染色，检测６。半乳糖苷酶的阳性表达率上升，初步说明细胞己呈现衰老状况。在本实验过程中，设置转染空质粒组作为阴性对照组，用ＣＣＫ．８法和流式细胞术检测转染前后ｐ１６对细胞增殖和细胞周期的影响时，ｐ１６过表达组２９３细胞增值较正常组明显下降，细胞周期ＧＯ／Ｇ１期的比例较正常组明显上升。理论上转染空质粒组和正常组２９３细胞的增殖和周期情况应相差不大，结果发现转染空质粒组的细胞增殖较正常细胞组有所下降，转染空质粒组的细胞周期ＧＯ／Ｇ１期的比列较正常组有所上升，这是因为在２９３细胞转染过程中，２９３细胞贴壁不紧，换液过程中极易从瓶底脱落，用脂质体转染之后中不易洗的遍数过多，有可能造成脂质体残留于培养基中，转染转染试剂脂质体有毒，会对细胞造成一定的伤害，影响到细胞增殖和细胞周期，故出现本实验中结果。总之，本研究在成功构建ｐ１６过表达载体的基础之上，首先将过表达载体转染２９３细胞，使用ＣＣＫ．８法和流式细胞术分别观察细胞增殖和细胞周期，然后以半定量ＰＣＲ检测ｐ１６和衰老相关基因ｐ２１的表达，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法检测ｐ１６及ｐ２１的表达变化。最后通过ｐ．半乳糖苷酶染色实验检测ｐ１６高表达对细胞衰老的影响和调控。从而验证ｐ１６基因是细胞衰老的原因，在细胞衰老过程中发挥调控作用。为下一步，构建ＲＮＡ干扰片段，沉默ｐ１６表达，移植衰老动物模型，延缓细胞和机体的衰老，延长机体寿命打下基础。２７Ｐ１６基因高表达对细胞衰老的调控及机制研究４主要结论和进一步的研究设想４，１本研究的主要结果和结论（１）本实验通过合成带有酶切位点的ｐ１６引物，利用ＲＴ．ＰＣＲ方法扩增ｐ１６基因全长ＯＲＦ序列，然后将其双酶切连接至ＰＥＧＦＰ—Ｎ１载体，通过转化、挑菌和测序鉴定，成功构建含有ｐ１６基因的重组载体ｐＥＧＦＰＮｌ．ｐ１６。（２）在成功构建ｐ１６过表达载体的基础上，利用脂质体转染法将过表达载体转染２９３细胞，并设正常组和转染空质粒组做对照。然后通过ＣＣＫ．８法和流式细胞术分别检测ｐ１６过表达对２９３细胞增殖和细胞周期的影响，结果发现ｐ１６过表达载体的转染在一定程度上抑制了２９３细胞增殖和生长，并将细胞周期阻滞在Ｇ０／Ｇ１期；ＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ实验说明ｐ１６过表达可以上调细胞衰老相关标记基因ｐ２１的表达，说明ｐ１６可能通过促进ｐ２１的表达导致细胞衰老；而ｐ．半乳糖苷酶染色实验直观的说明ｐ１６高表达可以造成细胞衰老。４．２进一步研究设想（１）本研究初步证明ｐ１６高表达可以促进Ｐ２１高表达，但是ｐ１６和ｐ２１在促进细胞衰老过程中上下游关系还不确定，具体的调控机制和调控过程还有待进一步分析。如果能够通过免疫共沉淀、凝胶阻滞实验（ＥＭＳＡ）等分析ｐ１６．ｃｙｃｌｉｎＤ／ＣＤＫ．Ｒｂ信号途径和ｐ２１蛋白在细胞衰老过程中的相互调控过程和机制可进一步完善人们对细胞衰老本质的了解和认识。（２）本研究初步探讨ｐ１６过表达对细胞衰老的影响，进一步实验可以通过ＲＮＡ干扰等方法沉默或降低ｐ１６的表达，进而为探索延缓细胞衰老的机制和方法提供理论。参考文献参考文献【１］ＷａｎｇｂｙＪ，ＳｈｏｕＪ，ＣｈｅｎＸ．Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－１，ａｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｔｈｅＷｎｔｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ，ｉｓｉｎｄｕｃｅｄｐ５３［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０００，１９（１４）：１８４３～１８４８．Ｒ，ＦｕｍａｇａｌｌｉＭ，ＣｉｃａｌｅｓｅＡ，ｅｔａ１．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．ｉｎｄｕｃｅｄｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ【２］ＤｉＭｉｃｃｏｉｓａＤＮＡｄａｍａｇｅｒｅｓｐｏｎｓｅｔｒｉｇｇｅｒｅｄｂｙＤＮＡｈｙｐｅｒ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００６，４４４（７１１９）：６３８～６４２．ａｎｄｐｌ６＜ｓｕｐ＞ＩＮＫ４ａ＜／ｓｕｐ＞［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，［３】ＳｅｒｒａｎｏＭ，ＬｉｎＡＷ，ＭｃＣｕｒｒａｃｈＭＥ，ｅｔａ１．Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ＜》ｒａｓ＜／ｉ＞ＰｒｏｖｏｋｅｓＰｒｅｍａｔｕｒｅＣｅｌｌＳｅｎｅｓｃｅｎｃｅＡｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＡｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｐ５３１９９７，８８（５）：５９３～６０２．【４】ＧｕｏＧＥ，ＭａＬＷ＇ＪｉａｎｇＢ，ｅｔａ１．Ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅｉｎｄｕｃｅｓｐ１６ＩＮＫ４ａｔｈｒｏｕｇｈｏｆｃｅｌｌｕｌａｒａｎＡＵＦｌ’ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ［Ｊ］．Ｊｏｕｍａｌｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，１０９（５）：１０００～１００５．［５】郑文婕，童坦君，张宗玉，等．细胞衰老的重要通路：ｐ１６ＩＮＫ４ａ／Ｒｂ和ｐ１９ＡＲＦ／ｐ５３／ｐ２１Ｃｉｐｌ信号途径【Ｊ】．生命的化学，２００２，２２（４）：３１４－３１６．【６】ＳａｌｌｉｎｅｎＳＬ，ＳａｌｌｉｎｅｎＰＫＫｏｎｏｎｅｎＪＴ＇ｅｔａ１．ＣｙｃｌｉｎＤ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａｓｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｐａｔｉｅｎｔｐｒｏｇｎｏｓｉｓ［Ｊ］．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９９，１８８（３）：２８９－２９３．［７】ＭｃＣｏｎｎｅＵＣＤＫ４ＢＢ，ＧｒｅｇｏｒｙＦＪ，ＳｔｏｔｔＦＪ，ｅｔａ１．Ｉｎｄｕｃｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｌ６ＩＮＫ４ａＣＤＫ２－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｂｙｉｎｈｉｂｉｔｓｂｏｔｈａｎｄｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔｏｆｃｙｃｌｉｎ—ＣＤＫ－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ９８９．ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，ｌ９（３）：ｌ９８１～ｌ【８】ＳｅｒｒａｎｏＭ，Ｌｅｅ［９】ＲａｓｔｏｇｉａｎｄＣｅｌｌＭｏｒｔａｌｉｔｙ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，１９９６，８５（１）：２７－３７．ＨＷ，ＣｈｉｎＬ，ｅｔａ１．Ｒｏｌｅｏｆｔｈｅ＜》ＩＮＫ４ａ＜／ｉ＞ＬｏｃｕｓｉｎＴｕｍｏｒＳｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎＳ，ＪｏｓｈｉＢ，ＤａｓｇｕｐｔａＰ，ｅｔａ１．ＰｒｏｈｉｂｉｔｉｎｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓｃｅｌｌｕｌａｒｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｂｙｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓｔｏｉｎｈｉｂｉｔＥ２Ｆｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，２６（１１１：４１６１－４１７１．［１０】ＨａｓｈｉｇｕｃｈｉＹ＇ＴｓｕｄａＨ，ＹａｍａｍｏｔｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｏｖａｒｉａｎＫ，ｅｔａ１．Ｃｏｍｂｉｎｅｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐ５３ａｎｄＲＢｐａｔｈｗａｙｓｉｎｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００１，３２（９）：９８８～９９６．ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｈｕｍａｎ［１ｌ】ＭｉｔｃｈｅｌｌＰＪ，Ｐｅｒｅｚ－ＮａｄａｌｅｓＥ，ＭａｌｃｏｌｍＤＳ，ｅｔａ１．ＤｉｓｓｅｃｔｉｎｇｔｈｅＣｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｐｌ６ＩＮＫ４ＡａｎｄｔｈｅＲｂＦａｍｉｌｙｔｏｔｈｅＲａｓＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＰｈｅｎｏｔｙｐｅ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，２３（７）：２５３０～２５４２．［１２］ＺｈｏｕＲ，ＨａｎＬ，ＬｉＧ＇ｅｔａ１．Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｌａｙａｎｄｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｌ６１ＮＫ４ａｂｙＬｓｈｖｉａｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔｏｆｈｉｓｔｏｎｅｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓｉｎｈｕｍａｎｄｉｐｌｏｉｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９，３７（１５）：５１８３～５１９６．［１３】Ｒｏｎｉｎｓｏｎ【１４］ＩｔａｈａｎａＩＢ．Ｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎｃａｎｃｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，２００３，６３（１１）：ｄｅｔｅｃｔｂｉｏｍａｒｋｅｒｓｏｆｃｅｌｌｕｌａｒ２７０５～２７１５．Ｋ，ＣａｍｐｉｓｉＪ，ＤｉｍｒｉＧＰ．Ｍｅｔｈｏｄｓｔｏｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ［Ｍ］／／ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｇｉｎｇ．Ｈｕｍａｎａ［１５】ＳｅｒｒａｎｏＭ，ＬｉｎＰｒｅｓｓ，２００７：２１－３１．ＡＷ，ＭｃＣｕｒｒａｃｈＭＥ，ｅｔａ１．Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ＜》ｒａｓ＜／ｉ＞ＰｒｏｖｏｋｅｓＰｒｅｍａｔｕｒｅＣｅｌｌＳｅｎｅｓｃｅｎｃｅＡｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＡｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｐ５３ａｎｄｐｌｌ９９７，８８（５）：５９３～６０２．６＜ｓｕｐ＞ＩＮＫ４ａ＜／ｓｕｐ＞［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２９参考文献［１６】Ｍｙ６ｈ／ｉｎｅｎ【１７】ＧｕｏＳＫ，ＢａｙｌｉｎＳＢ，ＨｅｒｍａｎＪＧＨｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｃａｎｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙｓｉｌｅｎｃｅｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｐ１６ｉｎｋ４Ａａｌｌｅｌｅｓｉｎｎｅｏｐｌａｓｉａ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９８，５８（４）：５９１～５９３．ａｉｌＧＥ，ＭａＬＷ，ＪｉａｎｇＢ，ｅｔａ１．Ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅｉｎｄｕｃｅｓｐ１６ＩＮＫ４ａｔｈｒｏｕｇｈＡＵＦｌ‘ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｅｌｌｕｌａｒｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，１０９（５）：１０００Ｎ１００５．ｏｎ【１８】ＰｉｍＤ，Ｂａｎｋｓ［１９】ＡｌｅｏｒｔａＬ．ｐ５３ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｖａｒｉａｎｔｓａｔｃｏｄｏｎ７２ｅｘｅｒｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｅｌｌｃｙｃｌｅｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｊｏｕｒｎａｌｐ１６（ＩＮＫ４ａ）ｉｎ【２０】Ｓｃｌａｆａｎｉｃａｎｃｅｒ，２００４，１０８（２）：１９６～１９９．ＤＡ，ＸｉｏｎｇＹＰｈｅｌｐｓＤ，ｅｔａ１．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅｃｙｃｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｉｎｈｉｂｉｔｏｒｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｏｆｎｏｒｍａｌｈｕｍａｎｆｉｂｍｂｌａｓｔｓ［Ｊ】．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１９９６，９３：１３７４２～１３７４７．ＲＡ．ＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｏｆＬａｔｅＳｔａｇｅＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＴａｒｇｅｔｅｄＴｏｗａｒｄｓＣｅｌｌＣｙｃｌｅＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＣｏｍｐｏｎｅｎｔｓ［Ｒ］．ＣｏｌｏｒａｄｏＵｎｉｖＡｔＨ，ＲｏｌｌｗｉｔｚＩ，ｅｔＤｅｎｖｅｒ，２０００．【２１】ＰａｐｐＴ＇ＰｅｍｓｅｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃａｌａ１．ＭｕｔａｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆＮ－ｒａｓ，ｐ５３，ＣＤＫＮ２Ａｇｅｎｅｓｉｎｈｕｍａｎｄｙｓｐｌａｓｔｉｃｍｅｌａｎｏｃｙｔｉｃ（ｐ１６ＩＮＫ４ａ），ｐ１４ＡＲＦ，ＣＤＫ４，ａｎｄＭＣｌＲ【２２】ＭａｒｕｓｙｋＡ，Ｗｈｅｅｌｅｒ［２３】ＣａｎｏＬＪ，Ｍａｔｈ【ｅｗｓＣｎａｅｖｉ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００３，４０（２）：ｅ１４～ｅ１４．Ｋｅｔａ１．ｐ５３ｍｅｄｉａｔｅｓｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ｌｉｋｅａｒｒｅｓｔｉｎｄｕｃｅｄ１．ａｂｙｃｈｒｏｎｉｃｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎａｌｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，２７（１５）：５３３６－－５３５ｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９，６９（１）：２１９Ｎ２２６．ＣＥ，ＧｏｍｍｅａｕｘＪ，ＰｉｅｔｒｉＳ，ｅｔａ１．Ｔｕｍｏｒｐｒｏｔｅｉｎ５３－ｉｎｄｕｃｅｄｎｕｃｌｅａｒｐｒｏｔｅｉｎ１ｉｓｏｆｐ５３ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｍａｊｏｒｍｅｄｉａｔｏｒ［２４】Ｄｈａｗａｎ［２５］ＢｒａｃｋｅｎｎＳ，ＴｓｃｈｅｎＳＩ，ＢｈｕｓｈａｎＡ．Ｂｍｉ一１ｒｅｇｕｌａｔｅｓｔｈｅＩｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｃｕｓｔｏｃｏｎｔｒｏｌ１．ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ１３一ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ＆ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００９，２３（８）：９０６－－－９１ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＣａｎｃｅｒ，２００９，９（１１）：７７３～７８４．Ｓ，ＢｅｃｋｅｒＴＭ，ＳｃｕｒｒＬＬ，ｅｔａｌ，ｐｌ６ＩＮＫ４ａ’ｉｎｄｕｃｅｄＡＰ，ＨｅｌｉｎＫ．Ｐｏｌｙｃｏｍｂｇｒｏｕｐｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｎａｖｉｇａｔｏｒｓｏｆｌｉｎｅａｇｅｐａｔｈｗａｙｓｌｅｄａｓｔｒａｙＩ【２６】Ｈａｆｅｒｋａｍｐｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｉｓｄｉｓａｂｌｅｄｂｙｍｕｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ａｇｉｎｇｃｅｌｌ，２００８，７（５）：７３３～７４５．［２７］ＨａｎＸ，ＷｕＦ，ＺｈａｎｇＺ，ｅｔａ１．Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐ２１Ｗａｆｌｐ１６ＩＮＫ４ｉｎｈｕｍａｎｄｉｐｌｏｉｄｅｎｇｌｉｓｈｅｄｉｔｉｏｎ，２００７，１ｍｅｌａｎｏｍａ‘ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｅｃｔｏｐｉｃｏｕｒｎａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃａｌｅｄｉｃａｌｊｏｕｒｎａｌｂｅｉｊｉｎｇ２０（５）：４０５～４０９．［２８】闰海龙，龚勇珍．氧化应激及ｐ１６和ｐ５３／ｐ２１与细胞衰老关系的研究进展【Ｊ】【Ｊ】．医学综述，２０１ｌ，１７（５）：６８２～６８５．【２９】马宏，张宗玉，童坦君等．衰老的生物学标志【Ｊ】．生理科学进展，２００２，３３（１）：６５Ｎ７０．［３０】李平，童煜，毛萌．端粒／端粒酶与代谢综合征及其发展起源的关系［Ｊ】．中国当代儿科杂志，２０１０，１２（１２）：１００８－１０１２．［３１】ＹａｎｇＮＣ，ＨｕＭＬ．Ｔｈｅｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓａｎｄｖａｌｉｄｉｔｉｅｓｏｆｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄ－１３一ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙａｓａｎａｇｉｎｇｍａｒｋｅｒｆｏｒｈｕｍａｎｆｏｒｅｓｋｉｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔＨｓ６８ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ，２００５，４０（１０）：８１３－８１９．［３２］秦燕，宁正祥，胡新宇．ｐ一半乳糖苷酶的应用研究进展［Ｊ］．沈阳农业大学学报，２０００，３１（６）：５９５～５９９．［３３】ＮｕｃｅｒａＣ，ＭｕｚｚｉＰ，ＴｉｖｅｒｏｎＣ，ｅｔａ１．Ｍａｔｅｒｎａｌｔｈｙｒｏｉｄｈｏｒｍｏｎｅｓａａｒｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙａｃｔｉｖｅｄｕｒｉｎｇｅｍｂｒｙｏ－ｆｏｅｔａｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｒｅｓｕｌｔｓｆｒｏｍｎｏｖｅｌｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ３０参考文献ｏｆｃｅｌｌｕｌａｒａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１０，１４（１０）：２４１７～２４３５．【３４】ＪａｎｚｅｎＶＦｏｒｋｅｒｔｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｐｌＲ，ＦｌｅｍｉｎｇＨＥ，ｅｔａ１．Ｓｔｅｍ—ｃｅｌｌａｇｅｉｎｇｍｏｄｉｆｉｅｄｂｙｔｈｅｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ６ＩＮＫ４ａ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００６，４４３（７１１Ｏ）：４２１－－－４２６．［３５】ＮｉｓｈｉｎｏｂｕｔＮｏｔＪ，ＫｉｍＩ，ＣｈａｄａＫｅｔａ１．Ｈｍｇａ２ＰｒｏｍｏｔｅｓＮｅｕｒａｌＳｔｅｍＣｅｌｌＳｅｌｆ－ＲｅｎｅｗａｌｉｎＹｏｕｎｇＯｌｄＭｉｃｅｂｙＲｅｄｕｃｉｎｇｐ１６＜ｓｕｐ＞Ｉｎｋ４ａ＜／ｓｕｐ＞ａｎｄｐ１９＜ｓｕｐ＞Ａｒｆ＜／ｓｕｐ＞Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００８，１３５（２）：２２７～２３９．【３６】ＭｏｌｏｆｓｋｙＡＶＳｌｕｔｓｋｙＳｑＪｏｓｅｐｈＮＭ，ｅｔａ１．Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｐ１６ＩＮＫ４ａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｅｃｒｅａｓｅｓｆｏｒｅｂｒａｉｎｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓａｎｄｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓｄｕｒｉｎｇ【３７】ＴｏｒｅｌｌａＤ，ＲｏｔａＭ，ＮｕｒｚｙｎｓｋａＤ，ｅｔａｎｄｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－１ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，９４（４）：５１４～５２４．ａｇｅｉｎｇ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００６，４４３（７１１０）：４４８－４５２．ａ１．Ｃａｒｄｉａｃｓｔｅｍｃｅｌｌａｎｄｍｙｏｃｙｔｅａｇｉｎｇ，ｈｅａｒｔｆａｉｌｕｒｅ，［３８］ＫｉｍＷＹ，Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ２７（２）：２６５～２７５．【３９】ＫａｎｇＹＫＫｉｍＷａｎｄ８７７～８８３．１ＮＥ．ＴｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＩＮＫ４／ＡＲＦｉｎｃａｎｃｅｒａｎｄａｇｉｎｇ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００６，Ｈ，ＪａｎｇＪＪ．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧｌ一Ｓｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ（ｐ５３，ｐ１６，ｐ２７，ｃｙｃｌｉｎＤ１，Ｒｂ）Ｓｍａｄ４／Ｄｐｃ４ｉｎｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｈｕｍａｎｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００２，３３（９）：ｃｅｌｌ［４０】Ｈｏｎｇ［４１］ＳａｓａｋｉＨ，ＴａｋａｈａｓｈｉＫＩｃｈｉｓａｋａＴ，ｅｔａ１．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｂｙｔｈｅｐ５３－ｐ２１ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４６０（７２５９）：１１３２～１１３５．Ｓ，ＹａｍａｍｏｔｏＨ，ＫａｎｅｔｏＨ，ｅｔａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｓｏｆａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｏｆｐ５３，ｐ１６，ａｎｄＳＭＡＤ４ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｈｅｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌｐａｐｉｌｌａｒｙ－ｍｕｃｉｎｏｕｓｔｕｍｏｒｓｏｆｔｈｅｐａｎｃｒｅａｓ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｌｏｇｙｒｅｐｏｒｔｓ，２００３，１０（１）：２１－２５．【４２］ＲａｖｅｌｏｊａｏｎａＶ（ＳＡ·ｐ—Ｇａｌ）ｂｙｏｒＲｏｂｅｒｔＡＭ，ＲｏｂｅｒｔＬ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ·ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ１３－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｈｕｍａｎｓｋｉｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ｅｆｆｅｃｔｏｆａｄｖａｎｃｅｄｇｌｙｃａｔｉｏｎｅｎｄ－ｐｒｏｄｕｃｔｓａｎｄｆｕｃｏｓｅｒｈａｎｍｏｓｅ—ｒｉｃｈｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ［Ｊ］．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙａｎｄｇｅｒｉａｔｒｉｃｓ，２００９，４８（２）：１５１～１５４．［４３］周碉，杨斌，姚欣，等．人参皂苷Ｒｇｌ延缓造血干细胞衰老与ｐ１６ＩＮＫ４ａ表达关系的研究【Ｊ】．中国中药杂志，２０１１，３６（５）：６０８～６１３．［４４］ＭａｔｈｏｎｒｏｄｅｎｔＮＦ，ＭａｌｃｏｌｍＤＳ，ＨａｒｒｉｓｉｎｇｈＭＣ，ｅｔａ１．Ｌａｃｋｏｆｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎｎｏｒｍａｌｇｌｉａ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９１（５５０５）：８７２－８７５．ＣＡ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ—ｉｎｄｕｃｅｄｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ：ｐｕｔｔｉｎｇｔｈｅｂｒａｋｅｓｏｎ［４５】ＢｒａｉｇＭ，Ｓｃｈｍｉｔｔ［４６］［４６】Ｍｕｒａｓａｗａｔｕｍｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，６６（６）：２８８１－２８８４．Ｓ，ＬｌｅｖａｄｏｔＪ，ＳｉｌｖｅｒＭ，ｅｔａ１．ＣｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｈｕｍａｎｔｅｌｏｍｅｒａｓｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｅｎｈａｎｃｅｓｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００２，１０６（９）：１１３３～ｌｌ３９．ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．３１综述ｐ１６信号通路与细胞衰老的研究进展刘静综述审校关方霞衰老是任何生物个体不可避免的生命现象，它是指机体的细胞、组织与器官在结构和功能上逐渐出现不可逆转地全面的退化性变化，存在于任何生命的任何时期。细胞衰老最明显的特征是细胞周期的停滞，而ｐ１６基因是参与细胞周期调控的一种基本基因，其表达产物直接参与细胞增殖的负调节，ｐ１６基因编码产物ｐ１６蛋白是作用于细胞分裂周期（ＣｅｌｌＤｉｖｉｓｉｏｎＣｙｃｌｅ）关键酶之一的ＣＤＫ４的抑制因子。近年来发现它在细胞衰老过程中起重要作用，它在复制性衰老时多呈高表达。它是通过ｐ１６．ｃｙｃｌｉｎＤ／ＣＤＫ－－Ｒｂ途径来调控细胞周期的。本文主要对ｐ１６信号通路与细胞衰老的关系作一综述。１ｐ１６基因的发现与结构Ｐ１６基因作为一种肿瘤抑制基因（ＴｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎＧｅｎｅ），是美国冷泉实验室Ｋａｍｂ等【ｌ】于１９９３年发现的抗癌基因。Ｐ１６基因位于人类第９号染色体断臂的２区１带，即９ｐ２１，由３个外显子和２个内含子组成，第１个外显子的长度是１２６ｂｐ，第２个外显子的长度是３０７ｂｐ，第３个外显子的长度是１ｌｂｐ。ｐ１６ｒｅａｄｉｎｇ的ｃＤＮＡ克隆总长度为９６０ｂｐ，其中含有单一的开放读码框架（ｏｐｅｎｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），长度为４４４ｂｐ，编码的Ｐ１６蛋自由１４８个氨基酸组成。其直接参与细胞周期的调控，在细胞增殖中起到负调节作用【２’３】。２ｐｌ６基因的表达产物及功能Ｄｉｖｉｓｉｏｎｐ１６基因编码一个１６ＫＤ的蛋白，即Ｐ１６蛋白，定位于细胞核内，ＤａｖｉｄＢｅａｃｈ等已经证明了Ｐ１６蛋白是在细胞分裂周期（Ｃｅｌｌ细胞分裂周期有关激酶（ＣＤＫ４）的活性【４＇５】。细胞周期调节是一个极为复杂过程，近年来发现一类基因与细胞周期的调节密切相关，即细胞分裂周期基因（ｃｅｌｌｄｉｖｉｓｉｏｎＣｙｃｌｅ）ｄ？起作用，抑制与ｃｙｃｌｅ，ｃｄｃ基因），它们控制着细胞分裂的启动及各个时相的转换。Ｃｄｃ基因编码产物是蛋白激酶，参与调控细胞周期的Ｇ１期．ｓ期，Ｇ２期一Ｍ期的关键点转换。周期蛋白和周期蛋白依赖性蛋白综述激酶结合为复合物在细胞分裂过程中起正向调节作用，参与调控Ｇｌ期一Ｓ期的转换。而ｐ１６蛋白会与周期蛋白竞争结合周期蛋白依赖性蛋白激酶，导致周期蛋白不能与周期蛋白依赖性蛋白激酶结合为复合物，从而抑制了细胞周期的正常进行【６１。周期蛋白依赖性蛋白激酶（ＣＤＫ４）与周期蛋白（Ｃｙｃｌｉｎ）的复合体参与Ｇ，一Ｓ期转换的调控，Ｐ１６蛋白抑制ＣＤＫ４活性，阻止细胞进入Ｓ期，最终阻止细胞周期的进行，一旦ｐ１６基因缺失或突变导致功能缺失，就不能抑制ＣＤＫ４的活性，最终导致细胞无限增殖，加速肿瘤发生。总之，ｐ１６基因是一种非常重要的新的抗癌基因，一旦失活，则会引起细胞恶性增殖【．卜９１。３０１６一ｃｙｃ｜．ｎＤ／ＣＤＫ—Ｒｂ途径是调控细胞衰老的重要信号通路Ｐ１６蛋白是细胞衰老的关键效应物，影响细胞寿命和端粒长度，并非通过端粒酶起作用，而是借助于信号转导途径实现的【６１。其中，视网膜神经母细胞瘤蛋白（Ｒｂ）在细胞衰老信号通路中起重要作用。视网膜神经母细胞瘤蛋白（Ｒｂ）通过自身磷酸化和非磷酸化在细胞周期中发挥调控作用，低磷酸化或者未磷酸化状态Ｉ抽可与转录因子结合，从而抑制转录因子的转录激活功能，对细胞周期进行负调控，其中，转录因子（Ｅ２Ｆ）能启动ＤＮＡ的正常转录，低磷酸化或者未磷酸化状态Ｒｂ结合Ｅ２Ｆ，抑制细胞周期的正常进行【ｌｏ。１７】。Ｒｂ的活力受到磷酸化／脱磷酸化的控制。在细胞周期的初始阶段，Ｒｂ没有被磷酸化；在Ｇｌ、Ｓ、Ｇ２期和Ｍ期，大多数Ｒｂ已经被磷酸化。在Ｇ１期，Ｒｂ在细胞周期发挥调控作用是通过细胞周期蛋白激酶（ＣＤＫ）来调控Ｒｂ的磷酸化来实现的，从而在细胞周期中发挥调控作用。Ｉ妯在细胞周期早期的磷酸化由ＣＤＫ４／６与ＣｙｃｌｉｎＤ复合物来负责，Ｒｂ在细胞周期晚期的磷酸化由ＣＤＫ２和ｃｙｃｌｉｎＡ的复合物来负责。研究发现在衰老细胞中，Ｒｂ是以活性的低磷酸化生长抑制状态存在。这可能与激酶活力降低有关。Ｈａｒａ等【８】认为Ｒｂ对ｐ１６蛋白有负反馈调节作用，最近发现ｐ１６蛋白能够促进磷酸化的Ｒｂ蛋白的降解【１０】。ｐ１６蛋白和周期蛋白竞争结合周期蛋白依赖性蛋白激酶，导致周期蛋白不能与周期蛋白依赖性激酶结合为复合物，周期蛋白依赖性蛋白激酶不能被激活，从而Ｒｂ不能被磷酸化，低磷酸化Ｒｂ不能释放Ｅ２Ｆ转录因子，转录过程不能正常进行，细胞周期停滞。周期蛋白激酶（ＣＤＫ在细胞增殖中的重要作用，它们的活性被周期蛋白激综述酶抑制因子（ＣＤＫｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＣⅪ）所调控，周期蛋白激酶抑制因子（ＣＤＫｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＣＫＩ）与细胞衰老相关。ＣＫｌ分为２个家族：第１个是ＩＮＫ４家族，第２个是Ｃｉｐ／Ｋｉｐ家族。ＩＮＫ４家族有４个成员：ｐ１６ＩＮＫ４ａ，ｐ１５ＩＮＫ４ｂ，ｐ１８ＩＮＫ４ｃ，ｐ１９ＩＮＫ４ｄ。ＩＮＫ４家族ＣＫＩ抑制ＣＤＫ４．６激酶，参与调控Ｒｂ的非磷酸化使其处于生长抑制状态［５１。在衰老细胞中，Ｒｂ仅以其低磷酸化的生长抑制状态存在。这是因为在衰老细胞中，ｐ１６ＩＮＫ４ａ处于高水平表达，随着细胞分裂次数的上升，ｐ１６ＩＮＫ４ａ表达逐渐上调。研究发现ｐ１６基因中存在一个抑制ｐ１６基因转录的元件，这个元件被命名为“ＩＴＳＥ”，在ｐ１６基因转录过程中起负调控作用。而在年轻细胞中存在一个分子量约为２万４千道尔顿的蛋白质分子可以调控１ＴＳＥ使ｐ１６处于低表达水平【１７。２５】。衰老细胞中却没有该种蛋白分子，所以ｐ１６处于高表达水平。研究又发现，衰老细胞中ｐ１６的表达比年轻细胞中ｐ１６的表达高出１０．２０倍。４小结衰老是一个复杂的多环节的生物学过程，在这一过程中伴随着细胞形态和一系列相关基因表达的变化，Ｐ１６基因作为细胞衰老的关键效应物，在细胞衰老中起着遗传调控的作用，目前已有研究通过抑制衰老相关基因的表达，成功改善细胞的衰老状态，这将为下一步延缓机体衰老，改善机体衰老状态，延长机体寿命打下基础。而细胞衰老受机体环境和多种基因调控的共同影响，ｐ１６信号通路作为其中一个与细胞衰老相关的通路【１２－１６】，只能从一个角度说明一些衰老相关现剩２６。２８】。要想全面正确统一对细胞衰老的机制做一阐述，还需要结合多种衰老相关基因信号通路对细胞周期调控做进一步研究。参考文献参考文献ｎ１Ｊ口１ＪＷａｎｇＪ，ＳｈｏｕＪ，ＣｈｅｎＸ．Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－１，ａｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｔｈｅＷｎｔｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ，ｉｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｐ５３［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０００，１９（１４）：１８４３—１８４８．ＤｉＭｉｃｃｏＲ，ＦｕｍａｇａｌｌｉＭ，ＣｉｃａｌｅｓｅＡ，ｅｔａ１．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ—ｉｎｄｕｃｅｄｄａｍａｇｅｒｅｓｐｏｎｓｅｔｒｉｇｇｅｒｅｄｂｙＤＮＡｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｉｓａＤＮＡｈｙｐｅｒ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００６，４４４（７１１９）：ｉｎｖｏｌｖｉｎｇｐ５３ａｎｄｐｌ６ｉｓ６３８－－６４２．ｐ１ＪＬｉｎＡＷ：ＢａｒｒａｄａｓＭ，ＳｔｏｎｅＪＣ，ｅｔａ１．Ｐｒｅｍａｔｕｒｅａｃｔｉｖａｔｅｄｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ９．ＭＥＫ／ＭＡＰＫｍｉｔｏｇｅｎｉｃｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ＆ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９８，１２（１９）：３００８－３０１Ｈ１Ｊ陋１Ｊ陋１ＪⅣ１ＪＧｕｏＧＥ，ＭａＬＷ，ＪｉａｎｇＢ，ｅｔａ１．Ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅｉｎｄｕｃｅｓｐｌ６ＩＮＫ４ａｔｈｒｏｕｇｈ。ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｎＡＵＦｌｍａｎｎｅｒ［Ｊ］。Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｅｌｌｕｌａｒｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，１０９（５）：１０００～１００５．郑文婕，童坦君，张宗玉，等．细胞衰老的重要通路：ｐ１６ＩＮＫ４ａ／Ｒｂ和ｐ１９ＡＲＦ／ｐ５３／ｐ２１Ｃｉｐｌ信号途径【Ｊ】．生命的化学，２００２，２２（４）：３１４－－３１６．ＤｉｒｋｓＰＢ．ＲｕｔｈａＪＴ．Ｃｕｒｒｅｎｔｃｏｎｃｅｐｔｓｉｎｎｃｕｒｏ—ｏｎｃｏｌｏｎｇｙ，ｔｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｌｎ—ａｒｅｖｉｅｗＮｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．１９９７，４０（５）：１０００－１００９．ＬｒｗＣ，ＷｅｉｎｉｎｇｅｒＵ，ＺｅｅｂＭ，ｅｔａｌ。ＦｏｌｄｉｎｇＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｌｌＡｎｋｙｒｉｎＲｅｐｅａｔＰｒｏｔｅｉｎ：ＳｃａｆｆｏｌｄａｎｄＡｃｔｉｖｅＳｉｔｅＦｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＣＤＫＩｎｈｉｂｉｔｏｒｐ１Ｊｏｕｒｎａｌ９＜ｓｕｐ＞ＩＮＫ４ｄ＜／ｓｕｐ＞［Ｊ］．ｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，３７３（１）：２１９－２３１．Ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，１４７（１）：哆１ＪＭｏｒｉｔａＫ，ＳａｓａｋｉＨ，ＦｕｒｕｓｅＭ，ｅｔａ１．ＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｌａｕｄｉｎＣｌａｕｄｉｎ一５厂ｒｍｖｃｆＣｏｎｓｔｉｔｕｔｅｓＴｉｇｈｔＪｕｎｃｔｉｏｎＳｔｒａｎｄｓｉｎＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ１８５－１９４．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｅｌｌｐ１ＪＲａｓｔｏｇｉＳ，ＪｏｓｈｉＢ，ＤａｓｇｕｐｔａＰ，ｅｔａ１．ＰｒｏｈｉｂｉｔｉｎｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓｃｅｌｌｕｌａｒｓｐｅｃｉｆｉｃｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓｔｏｉｎｈｉｂｉｔＥ２Ｆｔａｒｇｅｔｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｂｙｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，２６（１１）：４１６１－－４１７１．ｎＴｏｒｅｌｌａＤ，ＲｏｔａＭ，ＮｕｒｚｙｎｓｋａＤ，ｅｔａ１．Ｃａｒｄｉａｃｓｔｅｍｃｅｌｌａｎｄｍｙｏｃｙｔｅａｇｉｎｇ，ｈｅａｒｔｆａｉｌｕｒｅ，ａｎｄｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－１ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，９４（４）：５１４～５２４．ｎｎ、Ｉ童坦君，张宗玉．衰老机制及其学说【Ｊ】．生理科学进展，２００７，３８（１）．ＰａｐｐＴ，ＰｅｍｓｅｌＨ，ＲｏｌｌｗｉｔｚＩ，ｅｔａ１．ＭｕｔａｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆＮ—ｒａｓ，ｐ５３，ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６ＩＮＫ４ａ），ｐ１４ＡＲＦ，ＣＤＫ４，ａｎｄＭＣｌＲ阻３ｇｅｎｅｓｉｎｈｕｍａｎｄｙｓｐｌａｓｔｉｃｍｅｌａｎｏｃｙｔｉｃｎａｅｖｉ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００３，４０（２）：ｅ１４～ｅ１４．ＭｉｔｃｈｅｌｌＰＪ，Ｐｅｒｅｚ－ＮａｄａｌｅｓＥ，ＭａｌｃｏｌｍＤＳ，ｅｔａ１．ＤｉｓｓｅｃｔｉｎｇｔｈｅＣｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｐ１６ＩＮＫ４ＡａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｔｈｅＲｂＦａｍｉｌｙｔｏｔｈｅＲａｓＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＰｈｅｎｏｔｙｐｅ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，２３（７）：２５３０－２５４２．［１４］ＣｈｅｎｇＭ，ＯｌｉｖｉｅｒＰ，ＤｉｅｈｌＪＡ，ｅｔａ１．Ｔｈｅｐ２１Ｃｉｐｌａｎｄｐ２７Ｋｉｐ１ＣＤＫ’ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ’ａｒｅｅｓｓｅｎｔｉａｌａｃｔｉｖａｔｏｒｓｏｆｃｙｃｌｉｎＤ．ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅｓｉｎｍｕｒｉｎｅｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ［Ｊ］。ＴｈｅｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅＥＭＢＯｊｏｕｒｎａｌ，１９９９，１８（６）：１５７１－１５８３．［１５］ＮｉｃｋｏｌｏｆｆＢＪ，ＣｈａｔｕｒｖｅｄｉＶＢａｃｏｎＰ’ｅｔａ１．Ｉｄ一１ｄｅｌａｙｓｂｕｔｄｏｅｓｎｏｔ３５个人简历个人简历刘静，女，汉族，生于１９８７年９月６日，河南省南阳市社旗人。２００７年９月至２０１１年７月就读于信阳师范学院生物科学专业，获学士学位；２０１１年９月至２０１３年６月就读于郑州大学生物工程系生物工程专业，获硕士学位。３７