（盐酸萘乙二胺法）
??? 一、目的与要求：
1.熟练掌握样品制备、提取的基本操作技能。
2.明确与掌握盐酸萘乙二胺比色法测定亚硝酸盐的基本原理及操作方法。 ??? 二、原理：
样品经沉淀蛋白质，除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，生成的重氮化合物，再与盐酸萘乙二氨偶合形成紫红色染料，此“染料”颜色的深浅与亚硝酸盐的含量成正比，其最大吸收波长为538nm ,可以测定吸光度并与标准比较定量。反应式如下：见教材P316
1． 重氮化反应： 2． 偶合反应：
三、样品、试剂与仪器 样品： 品名：
厂家：
试剂：
1. 蛋白质沉淀剂（公用）
（1） 饱和硼砂溶液：称取5克硼酸钠(Na2B07·10H20)，溶于100毫升热水中，冷却 后备用。
(2) 亚铁氰化钾溶液：称取10.6克亚铁氰化钾[K4Fe9(CN)5.3H2O]，溶于水后，稀释至
100毫升。
乙酸锌溶液：称取11g Zn(CHCOO)2 .2H2O加1.5mL冰乙酸，溶于水定容50mL。 2. 显色剂
（1）0.4％对氨基苯磺酸溶液：称取0.4克对氨基苯磺酸，溶于100毫升20％的盐酸 中，避光保存。 100ml/4组
（）0.2％盐酸萘乙二胺溶液：称取0.2克盐酸萘乙二胺，溶于100毫升重蒸馏水中， 避光保存。 100ml/4组
3. 亚硝酸钠标准原液：精密称取0.1000克于硅胶干燥器中干燥24小时的亚硝酸钠，
加水溶解移入500毫升容量瓶中，并稀释至刻度。此溶液每毫升相当于200微克亚硝酸钠。
4. 亚硝酸钠标准使用液(5μg NaNO2/ml)：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.00毫升，
置于200毫升容量瓶中，加重蒸馏水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于5μg亚硝酸钠。亚硝酸钠标准原液由教师提供。 5. 1：4盐酸
配制显色剂1用，每4组100ml。 仪器：
1. 小型绞肉机。 2. 721分光光度计。
3．25ml比色管 每组7支 ?? ?四、操作方法：
1. 样品处理：
称取5.0克经绞碎混匀的样品，置于50毫升干洁的小烧杯中，加入12.5毫升饱和硼砂溶液，以玻璃棒搅拌均匀，以70℃左右的重蒸馏水约300毫升分数次将样品全部洗入500毫升容量瓶中。（此容量瓶专用）
置沸水浴中加热15分钟，取出后冷至室温，然后一面转动一面加入5毫升亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5毫升乙酸锌溶液以沉淀蛋白质，加重蒸水至刻度，混匀，放置0.5小时，除去上层脂肪，清液用滤纸过滤，弃去初滤液约30毫升，收集滤液备用。 ??? 2.标准曲线绘制
准确吸取0.0、0.2、0．4、0．6、0.8、1.0毫升亚硝酸钠标准使用液(相当于含0、1、2、3、5μg亚硝酸钠)，分别置于25毫升比色管中，于标准与样品管中分别加入1毫升0.4％对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置反应3-5分钟后，
各加入0.5毫升0.2％盐酸萘乙二胺溶液，加重蒸馏水至刻度，加塞摇匀，静置15分钟，
用2厘米比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度，绘制标准曲线比较。
3．测定
准确吸取20毫升上述滤液于25毫升比色管中，按绘制标准曲线同样方法操作，于538nm处测吸光度，从标准曲线上查出测定用样液中亚硝酸钠的含量(μg/ml) 五、计算：
亚硝酸盐量可用mg／kg(或ppm)表示。
计算公式，请操作者自己推导，在实验报告中注明公式里各符号的物理意义。 六、说明 1． 蛋白质沉淀剂也可采用亚铁氰化钾和乙酸锌溶液，使产生的亚铁氰化锌与蛋白质产生共沉淀。
2. 硫酸锌(30%)溶液也可作为蛋白质沉淀剂。
3. 饱和硼砂溶液作用有二：一是亚硝酸盐提取剂，二是蛋白质沉淀剂。 4. 本实验用水应为重蒸馏水，以减少误差。
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