*CN102128936A*
(10)申请公布号 CN 102128936 A(43)申请公布日 2011.07.20
(12)发明专利申请
(21)申请号 201010613989.5(22)申请日 2010.12.30
(71)申请人贵州大学
地址550003 贵州省贵阳市蔡家关贵州大学
科技处(72)发明人周碧君 周思旋 文明 王开功
程振涛 岳筠 刘忠伟 汪德生温贵兰(74)专利代理机构贵阳中新专利商标事务所
52100
代理人程新敏(51)Int.Cl.
G01N 33/68(2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页
(54)发明名称
基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒(57)摘要
本发明公开了一种基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒，它包括50～200ml的重组蛋白包被、50～200ml阳性对照、50～200ml阴性对照、50～200ml封闭液、50～200ml的酶标二抗、50～200ml底物液及50～200ml终止液。本发明将纯化的Nsp10重组蛋白作为包被抗原，建立ELISA方法，优化反应条件，研制了基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒，通过ELISA检测结果与阴性对照及阳性对照比较，得到检测结论，该结论基本可以区分PRRS灭活疫苗免疫猪群和隐性感染猪群，为PRSS的临床诊断与预防控制提供参考依据；根据检测结果有选择性的对未感染猪群进行免疫，能减少免疫的盲目性，有效的避免经济损失。本发明具有较好的特异性、敏感性和可重复性等特点，使用效果好。
CN 102128936 ACN 102128936 ACN 102128944 A
权 利 要 求 书
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1.一种基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：它包括50~200μL重组蛋白包被、50~200μL阳性对照、50~200μL 阴性对照、50~200μL酶标二抗、50~200μL底物液及50~200μL终止液。
2.根据权利要求1所述的基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：它包括50~200μL重组蛋白包被、50~200μL阳性对照、50~200μL 阴性对照、50~200μL封闭液、50~200μL酶标二抗、50~200μL底物液及50~200μL终止液。
3.根据权利要求1所述的基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：它包括重组蛋白包被的浓度为0.922 μg/mL~59 μg/mL，阳性对照及阴性对照的稀释比例为1:10~1:320、酶标二抗的稀释度为1:500～1:2000。
4.根据权利要求1或3所述的基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：阳性对照为血清，阴阳性其临界值为0.32；阴性对照为未感染和未免猪繁殖与呼吸综合征疫苗的血清，稀释度为1:10～1:320。
5.根据权利要求4所述的基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：血清稀释液为BSA的浓度为1g/100mL、脱脂乳的浓度为5g/100mL、明胶的浓度为1g/100mL或FBS的浓度为5g/100mL的溶液。
6.根据权利要求1所述的基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：封闭液为BSA的浓度为1g/100mL、脱脂乳的浓度为5g/100mL或明胶的浓度为1g/100mL的溶液。
7.根据权利要求1所述的基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：底物液是邻苯二胺、杂环吖嗪或四甲基联苯胺。
8.根据权利要求1所述的基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：终止液是浓度为1～2 mol/L的硫酸或浓度为10 moL/L叠氮钠。
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说 明 书
基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒
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技术领域
[0001]
本发明涉及一种试剂盒，特别是基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒。
背景技术
猪繁殖与呼吸道综合征（PRRS）以母猪流产、早产、产弱死仔胎等繁殖障碍，仔猪呼吸困难、高死亡率和育肥猪呼吸道症状为特征的一种严重传染病，是目前危害养猪业重要的病原之一，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。由于PRRSV有抗体依赖性感染增强作用现象，临床可见接种PRRS疫苗后，猪群PRRS症状反而加剧，疫苗诱导机体产生的抗体增强了野毒在猪体内的复制。非结构蛋白是在病毒复制过程中产生的，只有机体处于病毒感染中才会产生，灭活苗免疫只产生相应的结构蛋白抗体。因此，若在不能区分PRRS灭活疫苗免疫猪群和隐性感染猪群的情况下就对猪群进行免疫，则可能发生上述现象发生，从而造成经济损失。
[0002]
发明内容
[0003] 本发明的目的是：提供一种基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒，它具有较好的特异性、敏感性和可重复性，基本可以区分PRRS灭活疫苗免疫猪群和隐性感染猪群，为PRSS的临床诊断与预防控制提供参考依据。[0004] 本发明是这样实现的：基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒，它包括50~200μL重组蛋白包被、50~200μL阳性对照、50~200μL 阴性对照、50~200μL酶标二抗、50~200μL底物液及50~200μL终止液。[0005] 它包括50~200μL重组蛋白包被、50~200μL阳性对照、50~200μL 阴性对照、50~200μL封闭液、50~200μL酶标二抗、50~200μL底物液及50~200μL终止液。[0006] 它包括重组蛋白包被的浓度为0.922 μg/mL~59 μg/mL，阳性及阴性对照血清的稀释比例为1:10~1:320、酶标二抗的稀释度为1:500～1:2000（根据酶标二抗产品说明书进行稀释。）。
[0007] 阳性对照为PRRSV分离毒注射于未免疫过的猪制备的阳性血清，阴阳性其临界值为0.32；阴性对照为未感染和未免猪繁殖与呼吸综合征疫苗的血清，稀释度为1:10～1:320。
[0008] 血清稀释液为BSA的浓度为1g/100mL、脱脂乳的浓度为5g/100mL、明胶的浓度为1g/100mL或FBS的浓度为5g/100mL的溶液。[0009] 封闭液为BSA的浓度为1g/100mL、脱脂乳的浓度为5g/100mL、明胶的浓度为1g/100mL或FBS的浓度为5g/100mL的溶液。[0010] 底物液是邻苯二胺、四甲基联苯胺或杂环吖嗪。
[0011] 终止液是浓度为1～2 mol/L的硫酸或浓度为10 mmol/L叠氮钠。[0012] 邻苯二胺（OPD）底物液的具体配方为：
显色底物溶液：在0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH5.0）中含20 mmol/L OPD和12 mmol/
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L H202，或10 mmol/L OPD和5.5mmol/L H202；终止液：2 mol/L硫酸（含0.1 mol/L亚硫酸钠）；测定波长：492nm。[0013] 四甲基联苯胺（TMB）底物液的具体配方为：
显色底物溶液：先将TMB以0.1 mol/L的浓度溶于二甲基亚砜，然后，再将其以1 mmol/L和H202以3.0 mmol/L的浓度溶于0.2mol/L醋酸钠/枸橼酸缓冲液（pH4.0），即可应用；终止液：2 mol/L硫酸；测定波长：450nm。[0014] 杂环吖嗪（ABTS）底物液的具体配方为：
显色底物溶液：先将ABTS以2 mmol/L和H202以2.5 mmol/L的浓度溶于0.1 mol/L醋酸盐缓冲液（pH 4.2），即可应用；终止液：10 mmol/L叠氮钠；测定波长；414nm或405nm。[0015] 1、PRRSV Nsp10基因的诱导表达
将PRRSV中的Nsp10基因连接至pET-32a表达载体，将阳性重组表达质粒转入BL21(DE3)中，并接种于LB液体培养基(含50 µg/mL Amp)中，培养至OD600值约为0.4～1.0时，加入IPTG至终浓度为l mmol/mL，30 ℃诱导培养5 h，离心收集菌体，用12%的聚丙烯凝胶进行SDS-PAGE电泳分析，结果见图1。[0016] 由图1可以看出，与对照菌BL21(DE3)/pET-32a和BL21(DE3)相比，重组菌表达Nsp10蛋白分子量约为43.4 kDa，与该蛋白的理论分子量相符，初步判定Nsp10重组蛋白获得了表达。[0017] 、包涵体溶解分析
包涵体经含6M尿素的1×Binding Buffer溶解1h以上，16000×g离心30 min后，离心管底几乎没有沉淀，说明目的蛋白基本溶解，主要存在于上清中。[0018] 、重组蛋白纯化结果
将包涵体溶解后用His·Bind Purification Kit中含Ni2＋的His Bind Resin与溶解的重组蛋白充分结合纯化，经多次洗涤后用含6M尿素的Elute Buffer洗脱，取洗脱液进行SDS-PAGE分析，结果见图2。由图2可以看出，经Elute Buffer洗脱后，除去了大部分杂蛋白，得到了较纯的目的蛋白。[0019] 、ELISA方法建立及初步应用
、抗原及血清最佳工作浓度测定结果 采用矩阵法设计不同稀释度(59 μg/mL、29.5 μg/mL、14.75 μg/mL、7.375 μg/mL、3.688 μg/mL、1.844 μg/mL、0.922 μg/mL) Nsp10蛋白与不同稀释度(1:10、1:20、1:40、1:80、1:160和1:320)阳性、阴性对照（血清）反应，测定其OD450nm值，并计算得出其P/N值(见表1)。选择P/N值最大且阴性对照背景值小的抗原浓度及阴、阳性血清稀释度作为抗原及血清的最佳工作浓度。
[0020] 表1 抗原最适包被浓度和血清稀释度的确定
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从表1可以看出，综合阴性对照和阳性对照OD450nm值高低、P/N比值大小、血清稀释度及抗原包被浓度等因素，确定抗原包被量为7.37 μg/mL，血清稀释度为1:40时，阴性对照背景值较低，且P/N值最大，为9.524。[0021] 、最适封闭液和血清稀释液的确定
以最适抗原浓度包被ELISA板，4 ℃过夜后，用不同的封闭液（1%BSA、5%脱脂乳、1%明胶、5%FBS、不封闭）进行封闭，37℃封闭1 h，测定各孔的OD450值，并计算P/N值，结果见图3。由图3可以看出，以5%脱脂乳做为封闭液和血清稀释液时，阴性对照OD450值最低，且P/N值最高。[0022] 、酶标二抗最佳工作浓度的确定
将酶标二抗分别以1:500、1:800、1:1000、1:1500和1:2000稀释，进行间接ELISA，测定其OD450值，结果见图4。由图4可以看出，当酶标二抗稀释度为1：1000时，且阴性血清OD值较低，此时P/N值最大。[0023] 、判定标准的确定
通过已建立的最佳ELISA反应条件，测定20份猪繁殖与呼吸综合征阴性血清样本，结果见表2。
[0024] 表2 ELISA测定结果
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经计算，以上20份阴性血清平均值X＝0.1635，标准差S＝0.049459，ELISA阴阳临界值＝X＋3S＝0.31187，为了便于鉴定，取0.32为阴阳性血清临界值。[0025] 、特异性试验结果
日本乙型应用本实验建立的ELISA方法，对猪瘟、猪伪狂犬病毒病、猪圆环病毒病型、脑炎和口蹄疫阳性和阴性血清进行检测，并做猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性和阴性血清对照，鉴定该方法的特异性，结果见表3。[0026] 表3 特异性检测结果
3结果显示，猪繁殖与呼吸综合征阳性和阴性血清对照均符合标准，而其他病毒病阴阳性血清值均为阴性(<0.32)，表明本次应用Nsp10蛋白建立的间接ELISA方法与猪瘟、猪伪日本乙型脑炎及口蹄疫血清均无交叉反应，初步验证了该狂犬病毒病、猪圆环病毒病型、方法的特异性。[0027] 4.6、重复性试验结果
用同一批制备的Nsp10纯化蛋白包被ELISA板，取3份阳性和1份阴性血清在5个酶标板上进行重复性试验，结果见表4。[0028] 表4 重复性试验结果
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由表4可知，对试验数据进行统计学分析，其变异系数位于2.5%～7.1%之间，均小于15%，说明同一样品在不同批次试验中变异程度小，重复性较好。[0029] 、敏感性试验结果
将纯化的重组蛋白包被ELISA板，阳性血清做1: 100，1: 200，1: 400，1: 800，1: 1600，1: 3200，l: 6400 7个稀释度，其余条件按最佳反应条件进行间接ELISA操作，结果见表5。
[0030] 表5 敏感性试验
由表5可知，当阳性血清稀释到1: 800时，检测样品OD450>0.32，仍为阳性，证明该方法敏感性较好。[0031] 、ELISA方法初步应用结果
采集203份非免疫或免疫PRRS灭活疫苗NVDC-JXA1株疫苗的猪血清，分别利用本试验所建立的间接ELISA方法和武汉科前动物生物制品有限责任公司生产的猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒(针对N蛋白抗体检测)检测分析血清样本中猪PRRSV非结构蛋白Nsp10抗体的产生情况，结果见表6。[0032] 表6 Nsp10和N蛋白抗体检测结果
从表6可以看出，灭活苗免疫猪群血清中，用Nsp10和武汉科前试剂盒N蛋白检测的血清阳性率分别为2.22%(2/90)和27.78%(25/90)，差异较大，而针对于未免血清，用Nsp10和N蛋白检测的血清阳性率分别为22.12% (25/113)和25.66%(29/113)，差异不明显，表明在
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未免猪群中，这两种蛋白检测结果比较吻合。[0033] 5、关于ELISA方法的建立
本实验利用试剂盒纯化的原核表达Nsp10重组蛋白作为包被抗原，经试剂盒纯化后，获得了较纯的目的蛋白，在一定程度上避免了应抗原不纯引起的假阳性结果的出现。通过矩阵法确定了最佳抗原包被浓度和血清稀释度，并得到阴阳性临界值OD450为0.32。通过采用不同的样品稀释液和封闭液，最终选择5g/100mL的脱脂奶粉，效果最好，减少了非特异性反应。目前对于PRRS的检测主要是采用IDEXX HerdChek ELISA试剂盒和武汉科前生物有限公司生产的针对N蛋白的ELISA试剂盒，前者采用细胞全病毒作为检测抗原，存在一些不足之处，如有较强的背景反应，病毒细胞培养的收获量有限，抗原制备成本高，抗原难以标准化，不同批次制备的病毒抗原差异较大，检测结果的敏感性与选用的抗原毒株有直接关系，潜在的散毒危险等；后者使用方便，经济实惠。但这两个试剂盒均是只能表明猪群体内是否存在PRRSV相应抗体，而不能区分抗体是由隐性感染产生还是疫苗免疫产生。病毒非结构蛋白在病毒复制增殖过程中得到表达，刺激机体产生抗体，而经纯化的病毒粒子中几乎没有非结构蛋白，因而，非结构蛋白抗体的产生较少。一般情况下，用灭活疫苗免疫的动物体内没有非结构蛋白抗体，而野毒株即活病毒感染动物体内既有结构蛋白抗体也有非结构蛋白抗体产生。因Nsp10蛋白是PRRSV的非结构蛋白，是病毒是在病毒复制过程中产生的，只有动物机体处于病毒感染中才会产生。目前，非结构蛋白作为抗原用于区分免疫和感染动物的方法已成功用于FMD、AI等病毒的临床检测，而对于PRRSV非结构蛋白，尚无市场化的试剂盒。本试验采用Nsp10蛋白作为包被抗原，成功建立了基于Nsp10的ELISA方法。临床检测表明，灭活苗免疫猪群血清中，用Nsp10和N蛋白检测的血清阳性率分别为2.22%和27.77%，差异较大；而针对于未免血清，用Nsp10和N蛋白检测的血清阳性率分别为22.12%和25.66%。本实验室长期对PRRS灭活苗免疫抗体监测结果显示，PRRS来活苗免疫水平不高，免疫后的猪群仍可能感染PRRSV，通过本次试验检测，免疫血清中仍有两份血清Nsp10抗体呈阳性，表明猪群中可能有PRRSV隐性感染。[0034] 由于采用了上述技术方案，本发明将纯化的Nsp10重组蛋白作为包被抗原，建立ELISA方法，优化反应条件，研制了基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒，通过ELISA检测结果与阴性对照及阳性对照比较，以得到检测结论，该结论可以区分PRRS灭活疫苗免疫猪群和隐性感染猪群，为PRSS的临床诊断与预防控制提供参考依据；根据检测结果有选择性的对未感染猪群进行免疫，能减少免疫的盲目性，有效的避免经济损失。本发明具有较好的特异性、敏感性和可重复性等特点，使用效果好。附图说明
附图1为Nsp10蛋白的SDS-PAGE分析；
横坐标中M：低分子量蛋白质Marker、1：阳性重组质粒转化BL21（DE3）、2 ：BL21（DE3）/pET-32a、3：BL21(DE3)；
附图2为Nsp10蛋白的纯化结果；横坐标中M：低分子量蛋白质Marker、1：纯化的Nsp10蛋白、 2：未纯化的Nsp10蛋白、3：空载体对照、4：BL21对照；
附图3为最适封闭液和血清稀释液的确定；
[0035]
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横坐标中1：1g/100mLBSA、2：5g/100mL脱脂乳、 3：1g/100mL明胶、4：5g/100mLFBS、5：不封闭；
附图4为酶标二抗最佳工作浓度的选择；横坐标中1：1:500、2：1:800、3：1:1000、4：1:1500、 5：1:2000。具体实施方式
[0036] 本发明的实施例1：基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒，它包括100μL浓度为7.37μg/mL的重组蛋白包被、100μL 阳性对照（阳性PRRSV分离毒注射于未免疫过的猪而制备的阳性血清）、100μL阴性对照（阴性对照采用未免也未感染过PRRSV病毒的血清）（阳性对照及阴性对照的稀释比例为1:40）、100μL封闭液（封闭液为脱脂乳，浓度为5g/100mL）、100μL四甲基联苯胺作为底物液、100μL浓度为2mol/L的硫酸作为终止液及100μL稀释度为1：1000的酶标二抗。[0037] 本发明的实施例2：基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒，它包括50μL浓度为59 μg/mL的重组蛋白包被、50μL 阳性对照（阳性PRRSV分离毒注射于未免疫过的猪而制备的阳性血清）、50μL阴性对照（阴性对照采用未免也未感染过PRRSV病毒的血清）（阳性对照及阴性对照的稀释比例为1:10）、50μL封闭液（封闭液为BSA，浓度为1g/100mL）、50μL杂环吖嗪作为底物液、50μL浓度为1mol/L的盐酸作为终止液及50μL稀释度为1：500的酶标二抗。
[0038] 本发明的实施例3：基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒，它包括200μL浓度为0.922 μg/mL的重组蛋白包被、200μL 阳性对照（阳性PRRSV分离毒注射于未免疫过的猪而制备的阳性血清）、200μL阴性对照（阴性对照采用未免也未感染过PRRSV病毒的血清）（阳性对照及阴性对照的稀释比例为1:320）、200μL封闭液（封闭液为明胶，浓度为1g/100mL）、200μL邻苯二胺作为底物液、50μL浓度为2mol/L的硫酸作为终止液及200μL稀释度为1：2000的酶标二抗。[0039] 上述BSA、脱脂乳、明胶或FBS在进行配比时，先将相应的物料按预定重量称量好后，放置于90mL灭菌的去离子水中进行溶解，然后定容至100mL即可。
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