锦鸡儿根瘤菌的抗逆性及其在寄主上结瘤、促生效果的研究

第３７卷第３期　内蒙古农业大学学报（自然科学版）　Ｖｏ１．３７　Ｎｏ．３　２０１６年５月　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）　Ｍａｙ．２０１６　锦鸡儿根瘤菌的抗逆性及其在寄主上结瘤、　促生效果的研究　田国杰，　王晗，　陈立红　（内蒙古农业大学农学院，呼和浩特０１００１９）　摘要：　对３株分离于内蒙古的锦鸡儿根瘤菌进行耐盐性、耐酸碱性、唯一碳、氮源利用能力的研究，并用这些菌株对锦鸡儿　进行蛭石一土壤回接试验筛选固氮高效的菌株。结果表明，菌株２一ｓ．和５—９表现出较好的耐酸碱性，可忍耐ｐＨ范围为　６．０～１０．０，最佳生长ｐＨ为７—８；菌株２一Ｓ．的耐盐性最好，可在盐浓度为２％的培养基上生长，菌株ＤＫ　和５—９次之，最　高可忍耐盐浓度为ｌ％；参试的１１种碳源，有８种均可被３种根瘤菌利用，３株根瘤菌均不能利用柠檬酸钠为唯一碳源，菌株　５—９利用碳源的能力最强，范围最广；唯一氮源利用实验显示，除（ＮＨ　）　ＳＯ　不能被菌株ＤＫ　所利用外，所有参试的１１种氮　源均可被３株菌株利用，菌株５—９可充分利用７种氮源，是利用氮源能力最强的菌株；盆栽回接试验表明，３株根瘤菌均表　现出较好的结瘤能力以及对植株不同程度的促生作用，菌株５—９对锦鸡儿的生长特性均表现出明显的促生作用。结论，菌　株５—９有着良好的耐酸碱性以及较强的碳、氮源利用能力，同时能够明显的促进植株生长，是良好的潜力菌株。　关键词：锦鸡儿根瘤菌；生理生化；回接试验　中图分类号：Ｑ９３８　文献标志码：Ａ　文章编号：１００９—３５７５（２０１６）０３—００１２—０９　ＤｏＩ：１０．１６８５３／ｊ．ｅｎｋｉ．１００９—３５７５．２０１６．０３．００３　ＴＨＥ　ＡＮＡＬＹＳＩＳ　ＯＦ　ＲＥＳＩＳＴＡＮＣＥ　ＯＦ　Ｒ．ｃａｒａｇａｎａ　ＡＮＤ　ＩＴＳ　ＮＯＤＵＬＡＲ，　ＣＡＴＡＬＹＳＥ　ＥＦＦＥＣＴＳ　ＯＮ　Ｃａｒａｇａｎａ　ＴＩＡＮ　Ｇｕｏｊｉｅ，　ＷＡＮＧ　Ｈａｎ，ＣＨＥＮ　Ｌｉｈｏｎｇ　（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｏｈｈｏｔ　０１００１９，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｒｅｅ　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｃａｇａｒａｎａ　ｉｎ　ｔｈｒｅｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ａｒｅａ　ｏｆ　Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ｗｅｓｔ　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅｉｒ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　ＮａＣＩ　ａｎｄ　ｐＨ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｎｌｙ　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅ　ａｎｄ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｓｏｕｒｃｅ，ａｎｄ　ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃａｇａｒａ—　ｎａ　ｕｓｉｎｇ　ｖｅｒｍｉｃｕｌｉｔｅ　ａｎｄ　ｓｏｉｌ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｓｔｒａｉｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ：ｓｔｒａｉｎ　２一Ｓｌ　ａｎｄ　５—９　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｂｅｔｔｅｒ　ａｃｉｄ—ａｌｋａｌｉ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ａｂｉｌｉｔｙ，ｓｕｐｐｏｒｔａｂｉｌｉｔｙ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ６．０—１．０，ａｎｄ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｉｔｈ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ７—８；Ｔｈｅ　ｓａｌｔ　—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｓｔｒｉａｎ　２一Ｓｌ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ，ｗｈｉｃｈ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｇｒｏｗｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｉｔｈ　ｓａｌｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　２％，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍａｘｉ—　ｍｕｍ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　ｓａｌｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　５—９　Ｗａｓ　１％；Ａｍｏｎｇ　１２　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅｓ　ｔｅｓｔｅｄ，８　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｔｉ—　ｌｉｚｅｄ　ｂｙ　ａｌｌ　ｏｆ　３　ｓｔｒａｉｎｓ，ａｌｌ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｃａｎ　ｎｏｔ　ｕｓｉｎｇ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ，ｔｈｅ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｔｈａｔ　５—９　ｓｔｒａｉｎ　ｕｓｉｎｇ　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｗｉｄｅｌｙ；Ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｏｆ　ｏｎｌｙ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｓｏｕｒｃｅ　ｓｈｏｗｅｄ　ａｌｌ　ｏｆ　１　１　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｓｏｕｒｃｅｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｔｉｌｉｚｅｄ　ｂｙ　３　ｓｔｒａｉｎｓ　ｅｘｃｅｐｔ　ｔｈｅ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｓｏｕｒｃｅｓ　ｏｆ（ＮＨ４）２ＳＯ４　ｃａｎ　ｎｏｔ　ｂｅ　ｕｔｉｌｉｚｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｓｔｒｉａｎ　ｏｆ　ＤＫ“，５—９　ｓｔｒａｉｎ　ｃａｎ　ｍａｋｅ　ｆｕｌｌ　ｕｓｅ　ｏｆ　７　ｎｉｒｔｏｇｅｎ　ｓｏｕｒｃｅｓ，ａｎｄ　ｈａｄ　收稿日期：２０１６—０２—２６　基金项目：国家自然科学基金项目（３１２６０１７３）。　作者简介：田国杰（１９８９一），男，硕士研究生，主要从事根瘤菌的研究。　｝通讯作者：Ｅ—ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｌｉｈｏｎｇ２９８９＠１２６．ｃｏｍ　第３期　田国杰等：锦鸡儿根瘤菌的抗逆性及其在寄主上结瘤、促生效果的研究　ｌ３　ｔｈｅ　ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｕｔｉｌｉｚｅｄ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｓｏｕｒｃｅ；Ｐｏｔ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　３　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｓｈｏｗｅｄ　ｂｅｔｔｅｒ　ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ａ—　ｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｌｅｖｅｌｓ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ，５－９　ｓｔｒａｉｎｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ｇｒｏｗｔｈ　ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓ—　ｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｃａｒａｇａｎａ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎ　５—９　ｈａｓ　ａ　ｇｏｏｄ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｆｏｒ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ａｌｋａｌｉ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　ｕｓｅ　ｃａｒｂｏｎ　ａｎｄ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｓｏｕｒｃｅｓ，ａｎｄ　Ｃａｎ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｐｌａｎｔ，ｉｔ　ｉｓ　ａ　ｇｏｏｄ　ｐｏｔｅｎｔｉｌ　ｓｔａｒａｉｎ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｃａｇａｒａｎａ；ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ；ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　根瘤菌主要指与豆科植物根部共生形成根瘤　项长远而艰巨的工作。本研究对在内蒙古西部采集　并能固氮的细菌。生物固氮中，豆科植物与根瘤菌　到的锦鸡儿根瘤菌进行耐盐、抗酸碱、唯一碳源和唯　这一共生体系固氮能力强、固氮量大、抗干旱、耐贫　一氮源利用等生理生化研究，同时，通过温室回接试　瘠，能有效提高土壤肥力、减少工业氮肥的使用量　并为人畜提供高蛋白质营养物质。据统计，全球豆　科植物所固定的氮量可达到１．１２×１０　ｔ，占整个生　物固氮总量的４／５，而且大大超过了全球工业合成　的氮产量（４×１０　ｔ），成为农业生产中的重要氮　源　Ｊ。因此，这一体系在推动农业可持续发展，治理　生态环境中具有非常重要的位置　Ｊ。　锦鸡儿属（Ｃａｒａｇａｎａ　Ｆａｂｒ．）植物隶属于豆科　（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）、蝶形花亚科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、山羊豆族　（Ｇａｌｅｇｅａｅ）。全世界约有８００多种，主要分布在欧　洲和亚洲干旱和半干旱地区。我国共有６６种，９变　种，１２变型　Ｊ，锦鸡儿（Ｃａｒａｇａｎａ）是我国北方大部　分地区特别是黄土高原和干旱风沙区的优良豆科　灌木，其鲜草产量高、饲用价值好，在放牧补饲方面　有着极为可观的作用，并且有着极强的生命力和耐　涝、耐贫瘠能力。这些特点使得锦鸡儿成为防风固　沙、水土保持、改善生态环境方面的先锋树种，对中　国西北、华北、东北西部水土保持和固沙造林有着　极为重要的作用　Ｊ。　根瘤菌与豆科植物是自然界中最高效的固氮　系统，豆科植物接种根瘤菌可以促进早接瘤、增加　从空气中固定的氮素量　Ｊ，提高豆科牧草的产量和　品质，并能改善和提高土壤肥力Ｌ６　Ｊ。目前，虽然豆科　植物一根瘤菌共生固氮已经引起各国高度的重视，　很多优良的菌株已被筛选出并制作成菌剂应用于　豆科植物生产中，在提高大豆、花生、苜蓿等豆科植　物的产量和品质的研究也有很多报道，但是对锦鸡　儿属植物根瘤菌的研究报道仍然较少　Ｊ，据Ａｌｌｅｎ　等统计，在与共生的豆科植物中，仅不足０．５％根　瘤菌有过研究，绝大部分根瘤菌尚未进行分离与研　究。因此探索锦鸡儿与根瘤菌这一共生体系是一　验，意旨筛选出一些促进锦鸡儿生长的高效根瘤菌　菌株。这不仅对开发锦鸡儿根瘤菌资源，助力根瘤　菌接种剂的研制具有实用价值，而且对北方地区锦　鸡儿根瘤菌的系统发育及分类也有一定的参考意　义。　１材料与方法　１．１供试菌株　３株根瘤菌菌株分离自内蒙古西部锦鸡儿生长　地区，其编号为菌株５—９、菌株ＤＫ　及菌株２一ｓ　。　１．２供试土壤　采用土壤和蛭石１：１混合物为栽培基质，土壤　为内蒙古农业大学农场土，土壤和蛭石用烘箱　１８０ｏＣ干热处理３ｈ。　１．３菌种活化及菌悬液的制备　将保存在４℃冰箱的菌株于平板划线，２８％培　养，连续划线培养３次，使菌株处于最佳生长状态。　挑取活化后的根瘤菌接种于ＹＭＡ培养基上，２８％　培养４ｄ后用无菌水冲脱菌体，接种在ＹＭＡ液体培　养基中，混匀菌体，通过加人无菌液体培养基调节菌　体密度，测定ＯＤ鲫　值，保证每种菌液浓度相同。　１．４生理生化实验的测定　１．４．１耐盐性检测在ＹＭＡ培养基中加入ＮａＣ１，　配成终浓度为０．５％，１％，１．５％，２％，２．５％（Ｗ／Ｖ）　的培养基，将活化的各测试菌株划线接种，以ＹＭＡ　平板为阳性对照，每个处理重复３次。２８℃恒温培　养７ｄ后观察结果并记录生长状况，不生长记录为　“”一，生长较差记录为“±”，生长一般记录为“＋”，　生长较好记录为“＋＋”，生长良好记录为“＋＋＋”。　１４　内蒙古农业大学学报（自然科学版）　２０１６年　１．４．２　耐酸碱性检测　用ＮａＯＨ和ＮａＣ１调节　理：接种菌株２一Ｓ　、接种菌株５—９、接种菌株ＤＫ甜　ＹＭＡ培养基的ｐＨ值为５．０，６．０，７．０，８．０，９．０，　和不接菌（ＣＫ），每个处理各２０盆，每盆播种３株已　１０．０，接人各测试菌株置于２８℃培养。接种、记录　萌发好的锦鸡儿种子，温室培养，２５ｄ后间苗，每盆　及测试同上。　留一株，保证各处理幼苗长势一致。后用注射器接　种各根瘤菌菌株于幼苗根部附近，每株接种１０ｍＬ，　１．４．３唯一碳源利用　以ＹＭＡ培养基为基础培养基，将其中甘露醇　对照处理注射ｌＯｍＬ　ＹＭＡ培养液。待植株生长６０ｄ　用半乳糖、山梨醇、麦芽糖、葡萄糖、木糖、琥珀酸、　后进行生理指标的测定。　淀粉、蔗糖、乳糖、柠檬酸钠和Ｄ一果糖１１种碳源替　１．６测定指标及测定方法　代，各测试碳源终浓度为１０　Ｌ，以ＹＭＡ平板为阳　６０ｄ后，将植株拔出洗净，测定株高、根长，并记　性对照，无碳培养基为阴性对照，２８￣Ｃ恒温培养７ｄ。　录瘤数与瘤重，然后分别收获地上和地下部分，　接种、记录及测试同上。　１０５￣Ｃ杀青，８０￣Ｃ烘干至恒重，研磨过１ｍｍ筛，用于　将ＹＭＡ培养基中的酵母　植株全氮含量测定。植株全氮测定：采用Ｈ　Ｓ０　一　１．４．４唯一氮源利用粉用ＮＨ　ＮＯ，、尿素、酸水解酪蛋白、（ＮＨ　）：ＳＯ　、　Ｈ　０　凯氏定氮法　；叶绿素含量测定采用丙酮一乙　ＮＨ　Ｃ１、ＮａＮＯ　、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏和大豆蛋　醇浸提法　。　白胨等ｌ０种氮源代替，各测试氮源终浓度为　１．７数据统计分析　０．８ｇ／Ｌ，以ＹＭＡ平板为阳性对照，无氮源培养基为　所有数据采用ＳＡＳ　软件（ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｉｎｃ．　阴性对照，２８ｃｃ恒温培养７ｄ。接种、记录及测试同　１９８９）进行单因素显著性检验，用Ｅｘｃｅｌ软件进行数　上。　据统计与作图。　１．５高效根瘤菌的筛选　１．５．１种子处理及接种试验设计锦鸡儿（Ｃａｒａ—　２结果与分析　ｇａｎａ　ｍｉｃｒｏｐｈｙｌｌａ　Ｌａｍ）种子经７５％酒精处理１０ｍｉｎ，　在用３０％的ＮａＣ１０灭菌１０ｍｉｎ，无菌水冲洗７次后　２．１生理生化特性分析　将种子放到垫有湿纱布的培养皿中（纱布和培养皿　２．１．１耐盐性测试结果从表１和图１可以看出　之前已灭菌），２８￣Ｃ避光培养催芽，间歇用无菌水冲　３株根瘤菌的耐盐性差异较大，菌株２一Ｓ　对盐浓　洗种子以保持湿度及种子干净。待种子发芽至１～　度的耐受能力最强，可在盐浓度为２％的培养基上　２ｃｍ时选取芽长一致的种子播种于已灭菌的小花盆　生长；菌株５—９和ＤＫ甜的耐盐能力次之，耐盐浓度　内，用于接种试验。　为１％。　试验采取完全随机排列设计。试验设４个处　表１　各菌株在不同盐浓度下的生长状况　Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓａｌｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ＮａＣ１（％。ｗ／ｖ）　菌株Ｓ￣ｍｎｓ　２一Ｓ１　５—９　ＤＫ４４　标注：“一”表示不生长，“±”生长较差，“＋”表示生长一般，“＋＋”表示生长较好，“＋＋＋”表示生长良好。下同　Ｎｏｔｅ：“一”ｓｔａｎｄｓ　ｆｏｒ　ｎＯ　ｇｒｏｗｔｈ．“±”ｐｏｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ．“＋”ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　ｇｅｎｅｒａ１．“＋＋”ｇｒｏｗｔｈ　ｂｅｔｔｅｒ．“＋＋＋”ｇｒｏｗｔｈ　ｖｅｒｙ　ｗｅｌｌ　第３期　田国杰等：锦鸡儿根瘤菌的抗逆性及其在寄主上结瘤、促生效果的研究　１５　ＣＫ　图ｌ　不同盐浓度对根瘤菌的生长影响　Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｓａｌｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　２．１．２耐酸碱性测试结果　从表２和图２可以看　和９．０的培养基上生长。菌株２一Ｓ，在ｐＨ为７．０　出３株菌株的耐酸碱性有所差异，菌株２一Ｓ．和５—　时生长最好，ｐＨ为８．０时，菌株５９和ＤＫ　生长最　９可在ｐＨ为６．０、７．０、８．０、９．０和１０．０的培养基上　佳。　生长，但当ｐＨ为１０．０时，它们的生长极其微弱；菌　株ＤＫ　的耐酸碱范围较小，只可在ｐＨ为７．０、８．０　表２各菌株在不同酸碱条件下的生长状况　Ｔａｂｌｅ　２　Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ａｃｉｄ　ａｎｄ＇ａｌｋａｌｉ　菌株Ｓｔｒａｉｎｓ　６　２一Ｓ　ｐＨ　９　１０　５—９　ＤＫ４４　９　ＩＩＩ　图２　ｐＨ对根瘤菌的生长影响　Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐＨ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　２．１．３唯一碳源利用结果　唯一碳源实验结果见　一碳源的培养基上生长良好，利用碳源能力最强；　表３和图３。参试的ｌ２种碳源中，除了木糖、琥珀　菌株２一Ｓ．在以木糖、甘露醇、葡萄糖和半乳糖为唯　酸、柠檬酸钠和Ｄ一果糖外，其余８种碳源均能被３　一碳源的培养基上生长良好，且明显好于其它处理；　株根瘤菌利用。３株根瘤菌均不能在以柠檬酸钠为　菌株ＤＫ“对碳源的利用范围较小，仅能在以甘露　唯一碳源的培养基上生长。但是不同菌株对碳源　醇、半乳糖为唯一碳源的培养基上生长良好，甘露醇　的利用差异仍然很大。菌株５—９可以在以甘露醇、　是菌株的最适碳源。　半乳糖、山梨醇、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖为唯　ｌ６　内蒙古农业大学学报（自然科学版）　２０１６年　２一Ｓｔ　５—９　＋＋＋　＋＋＋　＋＋＋　＋＋＋　＋＋＋　＋＋＋　＋＋＋　ＤＫ“　＋＋＋　＋＋＋　琥珀酸　Ｓｕｃｃｉｎｉｃ　ａｃｉｄ　２一ＳＩ　５—９　ＤＫ４４　一　４－　一　柠檬酸钠　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｃｉｔｒａｔｅ　蔗糖　Ｓｕｃｒｏｓｅ　淀粉　Ｓｔａｒｃｈ　Ｄ一果糖　Ｄ—Ｆｒｕｃｔｏｓｅ　＋＋　＋＋＋　＋＋　＋　＋～＋一　＋　一　一＋０　　＋　¨　¨　无Ｃ　木糖　柠糠酸　琥珀酸　果糖　淀粉　山梨醇　乳糖　麦芽糖　葡萄糖　蔗糖　半乳糖　图３根瘤菌在不同碳源下的生长测定　Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　Ｏｉｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ（：ａｒｈｏｎ　ＳＯＵｒ（‘ｅ　２．１．４唯一氮源利用结果　唯一氮源利用结果见　解酪蛋白胨、胰蛋白胨、ＮａＮＯ　、牛肉膏、酵母膏和大　表４和图４。参试的３种菌株，除了菌株ＤＫ　不能　豆蛋白胨为唯一氮源的培养基上均生长良好；菌株　以（ＮＨ　）　ＳＯ　作为唯一氮源外，其余ｌ０种氮源均可　２一ｓ，在以酵母粉、胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏为唯　被３种菌株利用，说明３株根瘤菌对氮源的利用范　一氮源的培养基上生长最佳；菌株ＤＫ　仅在酵母粉　围较为广泛。总体来看，３株根瘤菌对有机氮源的　和牛肉膏上生长良好，对其它氮源的利用均不理想。　利用率要高于无机氮源。在测试的１　１种氮源中，菌　株５—９能较好的利用多种氮源，在以酵母粉、酸水　第３期　田国杰等：锦鸡儿根瘤菌的抗逆性及其在寄主上结瘤、促生效果的研究　１７　无Ｎ　ＮＨ４ＮＯｊ　酸水解酪蛋白胨　ＮＨ４ＣＩ　大豆蛋白胨　酵母膏　牛内膏　胰蛋白胨　ＮａＮＯ，　尿素　图４根瘤菌在不同氮源下的生长测定　Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｏｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｓｏｕｒｃｅ　２．２不同菌株对锦鸡儿接种效果的结果　个菌株之间，只有在瘤数方面菌株５—９和ＤＫ驰显　２．２．１不同菌株对锦鸡儿结瘤状况的影响　表５　著高于２一Ｓ　，而在瘤重和结瘤率方面各接种菌株　反应出３株根瘤菌对锦鸡儿结瘤状况的影响。从中　之间均没有显著差异。其中菌株５—９的结瘤能力　可以看出所有对照组均没有根瘤生成，３株菌株均　最强，在结瘤数和瘤重方面均高于其它菌株，结瘤率　能不同程度的使锦鸡儿结瘤，单株结瘤率数为３．２～　也达到１００％（即所有接种的植株都结瘤）。综合考　８．０个，单株跟瘤重在９～１７ｒａｇ之间，结瘤率为　虑，３个菌株按竞争结瘤能力的排列顺序为５９＞　８２．２４％～１００％，且与对照相比，均有显著性差异。　各　ＤＫ　＞２一Ｓ１。　１８　内蒙古农业大学学报（自然科学版）　２０１６在　表５不同根瘤菌菌株对锦鸡儿结瘤固氮的影响　Ｔａｂｌｅ　５　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　Ｒ．ｃａｒａｇａｎａ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｎ　ｃａｒａｇａｎａｇ　ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｆｉｘａｔｉｏｎ　注：同一行中，不同小写字母表示显著差异（ｐ＜０．０５）。下同。　Ｎｏｔｅ：Ｉｎ　ｔｈｅ　８ａｌｎｅ　ｌｉｎｅ，ｎｅｔａ　ＳＨｏｗｅｄ　ｂｙ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｓｍａｌｌ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｍｅａｎ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　８ａｎｌｅ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ　２．２．２不同根瘤菌对锦鸡儿主要生育特征的影响　６４．２９％。本实验中，除接种菌株５—９的植株叶绿　根瘤菌对锦鸡儿主要生育特征的影响见表６和７。　素含量与对照相比达到显著性差异外，其它菌株对　从表中可以看出，与对照相比，接种根瘤菌后的锦　锦鸡儿幼苗的叶绿素含量影响都较小，增幅都超不　鸡儿在株高、根长、地上部分干重、叶绿素及植株全　过４％。植株全氮量代表着根瘤菌固氮能力，接种　氮量上均有不同程度的增加。在株高方面，接种菌　根瘤菌后，植株的全氮量均有不同程度的增加，可　株２一Ｓ　、５—９、ＤＫ　的幼苗株高增幅分别为　见供试菌株能有效增加锦鸡儿植株氮的含量。其　　外，其余两株菌株均达到显著水平，接种　２４．７６％、９０．１７％和３６．４３％，其中接种菌株５９的　中除２一ｓ幼苗株高增幅最明显，与对照相比达到显著水平。　５—９的植株增幅最大，高出对照１３．２５％，植株全氮　根长增幅达到显著性水平的为菌株２一Ｓ　和５—９，　量达１．６１５ｇ／ｋｇ。　分别高出对照２３．２０％、２９．０６％。植物地上部分干　通过对根瘤鲜重与各个生育特征进行相关系　根瘤鲜重与各个生育特征均存在正相　重通常可以反应出根瘤菌的固氮能力，从两表中可　数分析发现，以看出，接种３株根瘤菌对植株的地上部分干重有　关关系，其中根瘤鲜重与植株全氮量的相关系数已　明显促进作用，与对照相比，差异均达到显著性水　达到极显著水平，这也客观的反映出所结根瘤量可　　平，其中接种菌株５—９的幼苗地上干重增幅最大，　能可以作为衡量植株固氮能力的参考指标。单株地上部分干重达到１１５ｍｇ，比对照高出　表６不同锦鸡儿根瘤菌菌株对锦鸡儿主要生育特征的影响　Ｔａｂｌｅ　６　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｒ．ｃａｒａｇａｎａ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｎ　ｃａｒａｇａｎａ＇ｓ　ｍａｉｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　注：｝｛表示极显著水平。　Ｎｏｔｅ：ｎｅｔａ　ｆｏｌｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ｖｅｒｙ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　第３期　田国杰等：锦鸡儿根瘤菌的抗逆性及其在寄主上结瘤、促生效果的研究　１９　表７不同根瘤茵对小叶锦鸡儿各生长状况增长的百分率（％）　Ｔａｂｌｅ　７　Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　Ｃａｒａｇａｎａ　ｍｉｃｒｏｐｈｙＵａ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｒｈｉｚｏｈｉａ　ｓｔｒａｉｎｓ　株根瘤菌利用，柠檬酸钠是唯一均不被３株菌株所　３结论与讨论　利用的碳源。菌株５—９可充分利用甘露醇、半乳　糖、山梨醇、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖，碳源利用　耐酸碱性及耐盐性是衡量根瘤菌抗逆性的重　能力最强。在对唯一氮源利用的试验中，参试的１１　要指标＿１　“］。Ｖａｒｇａｓ和Ｇｒａｈａｍ在研究不同ｐＨ对　种氮源中，除（ＮＨ　）　ＳＯ　不能被菌株ＤＫ　所利用　菜豆根瘤菌竞争结瘤的影响时认为，在ｐＨ为４．５～　外，其余氮源均可被３株菌株利用，说明本实验中的　６．０的条件下，耐酸性较强的菌株具有更强的占瘤　各测试菌株利用氮源范围均很广泛。而就其利用能　能力ｕ　。还有研究表明，野生条件下，无论是在盐　力而言，菌株５—９的表现最佳，其可以较好的利用　碱土壤还是非盐碱土壤中，宿主植物均会优先与耐　酵母粉、酸水解酪蛋白胨、胰蛋白胨、ＮａＮＯ　、牛肉　盐性高的根瘤菌共生结瘤　；另外，Ｊｅｂａｒａ研究表　膏、酵母膏和大豆蛋白胨多种氮源。　明，接种耐盐性好的根瘤菌更利于苜蓿生长在盐碱　根瘤菌的结瘤能力及对宿主植物促生作用是筛　地中　。由此可见，耐酸碱性及耐盐性强的根瘤菌　选高效固氮菌株的重要标准。因此，本试验将瘤数、　更容易在土壤中生长、繁殖和分布，从而影响侵染　瘤鲜重、株高、地上植物干重、叶绿素含量及植株全　宿主产生根瘤。本研究中，菌株２一Ｓ　和５—９均表　氮量等指标用作高效菌株的筛选。本试验中，３株　现出较强的耐酸碱性，可在ｐＨ值为６．０～１．０之间　根瘤菌均表现出较好的结瘤能力，相比较而言，菌株　生长，最佳生长状态均表现在酸性偏碱（ｐＨ＝７—８）　５—９的结瘤较多且根瘤较大。接种根瘤菌后，植株　的条件下，这与李友国的研究结果一致　。对耐盐　各项生育特性均不同程度提高，表明３株供试根瘤　性的研究的结果表明，２一Ｓ，可以在２％的盐浓度下　菌表现出良好的促生作用；其中菌株５—９对锦鸡儿　生长，表现出最好耐盐能力；菌株５—９可在１％的　所有生育指标均表现出最为可观的促生效果，而且　盐浓度下生长。而高丽锋在研究毛乌素沙地中间　均达到显著水平。其相关性分析表明，根瘤鲜重与　锦鸡儿的抗逆性特征时发现，部分菌株可以在１０％　植株全氮量有极显著正相关性，相关系数达到　ＮａＣ１的培养基上生长＿ｌ　，冯建芳对巴彦淖尔市紫穗　０．９９４，而植株全氮量在一定程度上可以反映出根瘤　槐根瘤菌的抗盐性分析中也有发现，供试菌株可在　菌的固氮量，这一相关性结果与李项岳对如东田菁　７％ＮａＣ１的培养基上缓慢生长　，这种差异可能与　根瘤菌的研究一致Ｉ１　。但是本研究中，结瘤量最大　根瘤菌所生存的环境有关，陈文新认为，恶劣的土　的其植株全氮量和地上部分生物量也最大，这与李　壤环境更有利于塑造抗逆性强的根瘤菌菌株　。　项岳及张红侠的研究结果认为促生效果最强的根瘤　能够广泛的利用碳、氮源是根瘤菌适应各种土　菌其结瘤量并非最高不吻合＿２０　，这可能是因为本　壤环境的重要生存能力指标。本试验的研究结果　试验的测试菌株较少的缘故。但总体来说，本试验　表明，在参试的１２中碳源中，有８种碳源均可被３　证明结瘤量在一定程度上可以反映出根瘤菌的固氮　２０　内蒙古农业大学学报（自然科学版）　２０１６正　能力；菌株５—９在各项生育特性上的促生效果均最　为突出。　及遗传改造［Ｊ］．微生物学通报，２００２，２９（６）：８６—８９．　［１２］Ｖａｒｇａｓ　Ａ　Ａ　Ｔ，Ｇｒａｈａｍ　Ｐ　Ｈ．Ｃｕｈｉｖａｒ　ａｎｄ　ｐＨ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｎｏｄｕｌｅ　ｓｉｔｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｏｆ　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　通过初步筛选，本实验认为菌株５—９的促生效　果最为优越，同时可以忍耐ｐＨ：６—１０酸碱度水平　以及有着较为广泛的碳、氮源利用能力，因此，菌株　ｉｎ　ｂｅａｎｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　ｓｏｉｌ，１９８９，１１７：１９５—２００．　［１３］Ｉｂｒａｇｉｍｏｖａ　Ｍ　Ｖ，ＲｕｍｙａｎＬｓｅｖａ　Ｍ　Ｌ，Ｏｎｉｓｈｃｈｕｋ　０　Ｐ，Ｂｅｌｏ—　ｖａ　Ｖ　Ｓ，Ｋｕｒｃｈａｋ　Ｏ　Ｎ，Ａｎｄｒｏｎｏｖ　Ｅ　Ｅ，Ｄｚｙｕｂｅｎｋｏ　Ｎ　Ｉ，Ｓｉ—　５—９可作为后期田间试验的潜力菌株。　参考文献：　ｍａｒｏｖ　Ｂ　Ｖ．Ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｌｈｅ　ｒｏｏｔ—ｎｏｄｕｌｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｓｉｎｏｒｈｉａｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ａｎｄ　ａｌｆａｌｆａ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｌｉｖａ）ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，７５（２）：２４２　［１］张志权，束文圣，廖文波，等．豆科植物与矿业废弃地植被　恢复［Ｊ］．生态学杂志，２００２．２１（２）：４７—５２．　［２］徐开未，张小平，陈远学，等．凉山州新银合欢根瘤菌的共　生有效性及遗传多样性［Ｊ］．微生物学报，２０１４，５４（５）：　４９８—５０８．　［３］牛西午，史清亮，张强等．山西锦鸡儿根瘤菌资源分布于　生态学研究［Ｊ］．西北植物学报，２００３，２３（６）：９２１—９２５．　［４］牛西午．中国锦鸡儿属植物资源研究——分布及分种描　述［Ｊ］．西北植物学报，１９９９，１９（５）：１０７—１３３．　［５］胡跃高．知识密集型苜蓿产业建设理论与技术研究［Ｍ］．　北京：中国农业科学技术出版社，２００３．　［６］曾昭海，隋新华，胡跃高，等．紫花苜蓿一根瘤菌高效共生　体筛选及其田间作用效果研究［Ｒ］．北京：第二届中国首　蓿发展大会，２００３，６８—７０．　［７］严雪瑞，陈文峰，陈文新，等．小叶锦鸡儿根瘤菌的分离及　其１６Ｓ　ｒＤＮＡ　ＰＣＲ—ＲＦＬＰ分析［Ｒ］．华中农业大学学报，　２００７，２６（２）：１４１—１４６．　［８］鲍士旦．土壤农化分析［Ｍ］．北京：中国农业出版社，　２０００．　［９］郝建军，康宗利，于洋．植物生理学实验技术［Ｍ］．北京：　化学工业出版社，２００６．　［１０］刘杰，王赞文，李颖等．利用土壤筛选紫花苜蓿高效共生　根瘤菌的初步研究［Ｊ］．草业科学，２００５，２２（２）：２１—２５．　［１１］李友国，周俊初．影响根瘤菌共生固氮效率的主要因素　—２４７．　［１４］Ｊｅｂａｒａ　Ｍ，Ｍｈａｍｄｉ　Ｒ，Ａｏｕａｎｉ　ＭＥ，Ｇｈｒｉｒ　Ｒ，Ｍａｒｓ　Ｍ．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｉｎｏｒｈｉａｏｂｉｕｍ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒ—　ｅｎｔ　Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｖａｉｒｅｔｉｅｓ　ｃｕｈｉｖａｔｅｄ　ｉｎ　Ｔｕｎｉｓｉａｎ　ｓｏｉｌｓ［Ｊ］．ｃ。一　ｎａｄｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，４７（２）：１３９—１４７．　［１５］李友国，周俊初．导入额外拷贝ｎ／ｆＡ基因对费氏中华根　瘤菌ＨＮ０１ＮＬ根圈定殖－９竞争结瘤的影响（英文）［Ｊ］．　华中农业大学学报，２０００，１９（３）：１９８—２０３．　［１６］高丽锋．毛乌素沙地中间锦鸡儿根瘤菌遗传多样性对柠　条生态系统功能的影响［Ｄ］．北京：中国科学植物研究　所，２００１．　［１７］冯建芳，方亮，王素英等．紫穗槐根瘤菌抗逆性的初步　研究［Ｊ］．内蒙古农业大学学报（自然科学版），２０１１，３２　（４）：１５６—１５９．　［１８］陈文新，汪恩涛，陈文峰．根瘤菌一豆科植物共生多样性　与地理环境的关系［Ｊ］．中国农业学，２００４，３７（０６）：８１—　８６．李项岳．黄河三角洲根瘤菌遗传多样性、高效菌株筛　选及应用［Ｄ］．烟台：中国科学院大学，２０１５．　［１９］李项岳，李岩，姜南等．如东田菁根瘤菌多样性及高效促　生菌株筛选［Ｊ］．微生物学报，２０１５，５５（９）：１１０５—１１１６．　［２０］张红侠．黄土高原地区大豆根瘤菌遗传多样性、高效菌　株筛选及应用效果的研究［Ｄ］．北京：中国农业科学院，　２０１０．