DPPH法测定紫红薯提取物清除自由基的能力
2024-01-26
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—==132 第 卷第1期 31 们食品研究与开发 朋 - -J丌蹑 检测分析 DPPH法测定紫红薯提取物清除自由基的能力 王和才 --,胡秋辉 (1.苏州农业职业技术学院,江苏苏州215008;2.南京农业大学食品学院,江苏南京210095) 摘要:通过DPPH法测定紫红薯色素抗氧化、清除自由基的能力。试验表明,随着紫红薯色素浓度的增大,其抗氧 化能力也相应提高。与V 和芦丁比较,紫红薯色素抗氧化、除自由基能力低于Vc,但略高于芦丁。紫红薯色素清除 DPPH自由基的半抑制量为163 mg/mL,其清除自由基能力AE为0.006 1。 关键词:紫红著;紫色素;DPPH;抗氧化 Measuring the Antiradical Eficiency fof Purple Sweet Potato Pigment from Grape Seed by the DPPH‘Assay WANG He—cai。l_.HU Qiu-hui (1.Suzhou Agricultural College,Suzhou 2 1 5008,Jiangsu,China;2.Nanjing Agricultural University College of Food, Nanjing 210095,Jiangsu,China) Abstract:Determination of DPPH antioxidant pigment purple sweet potato,relnove free radicals.Experiments showed that with the purple sweet potato pigment concentrations increase,its antioxidant capacity have been increased.Rutin compared with the Vc and purple sweet potato antioxidant pigment,with the exception of the ability of free radicals than Vc,but higher than that of rutin.Purple sweet potato pigment and a half to clear the DPPH free radical inhibition capacity of 1 63 mg/mL.and its ability to remove free radicals 0.006 1 for A E. Key words:purple sweet potato;purple;DPPH;antioxidant 1956年,英国学者首先提出衰老的自由基学说, 从分子生物学角度解释了生命衰老现象。学说指出, 于使用天然抗氧化剂。本文用DPPH法测定了紫红薯 酸性水提物的抗氧化能力,为紫红薯提取物开发作为 天然抗氧化剂方面的应用提供科学依据。 1材料与方法 1.1仪器与材料 除遗传因素外,氧化物在动物呼吸过程中产生的氧自 由基造成机体损伤是衰老的原因。随着对自由基认识 的深入,近代医学指出,体内自由基反应与一些疾病的 发生、发展和老化进程密切相关,体内过剩的自由基对 构成组织细胞的生物大分子起攻击作用,使组织器官 的形态结构和生物功能的完整受到急性和慢性损伤, 一1.1.1仪器 TU一1901紫外可见分光光度计:北京普析通用仪 器有限公司;KQ~250DB超声波发生器:昆山超声仪器 有限公司;FA2004N电子天平:上海精科天平厂;RE-52A 旦损伤程度超过自身修复能力时,则出现疾病和衰 老的征象flj。食用油脂和富脂食品的酸败也是由自由 基引发而致,它不仅使油脂本身受到破坏失去营养, 而且其氧化产物和中间物会伤害生物膜、酶、维生素和 型旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂;ZK一82B电热真 空干燥箱:上海实验仪器厂有限公司;101FA一2电热鼓 风干燥箱:上海申光仪器仪表有限公司。 1.1.2材料与试剂 活细胞功能,其中有些是公认的致癌物。鉴于此,有关 抗氧化剂、清除自由基的研究得到了普遍关注,然而合 成的抗氧化剂往往有毒副作用,为此,人们越来越倾向 基金项目:江苏省高校自然科学研究计划项目(05KJDI50195);苏州 农业职业技术学院自然科学基金资助项 ̄1(200513) 紫红薯色素:以苏州天禾元农业开发有限公司提 供的紫红薯作原料,超声波辅助下,酸性水作提取剂进 行提取,提取液经X一5大孔吸附树脂吸附法精制,再经 SephadexG一50凝胶过滤层析法进一步精制得纯度较 作者简介:王和才(1964一),男(汉),副教授,本科,研究方向:食品成 分测定与化学分析。 高的紫色素;二苯代苦味酰基自由基(DPPH・):购自美 检测分析 食品研究与开发 第32010年1卷第1月 期 133==:一 国Sigma公司;无水乙醇、盐酸均为分析纯;V 、芸香糖 苷(芦丁):生化试剂级;X一5大空树脂:南开大学化工 厂;葡聚糖凝胶SephadexG一50:Pharmacia公司。 1.2方法 1.2.1 DPPH法测定紫红薯色素抗氧化、清除自由基 的原理 二苯代苦昧酰基自由基(DPPH・)是一种很稳定 的以氮为中心的自由基,若受试物能清除它,则表示 受试物具有降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基等 自由基的有效浓度,打断脂质过氧化链反应的作用。 DPPH・有个单电子,光谱扫描显示在516 nm处有强吸 收,其乙醇水溶液呈深紫色,加入受试物后,通过在 516 nm测定其清除DPPH自由基而引起吸光度减少 的情况可以反映受试物的抗氧化活性,计算其清除自 由基的能力口1。 试~验一,2 3 4 5 6 7 8 9 1.2.2标准曲线的绘制 号一 准确称取25 mg DPPH・用无水乙醇溶解并定容 于250 mL容量瓶中,作为标准储备液,则该DPPH・标 准储备液的质量浓度为lxl0 mg/mL(现用现配)。分 别取0、1、2、4、6、8、10 mL标准储备液在50 mL比色管 中50 mL刻度处定容,产生标准系列溶液,其质量浓度 依次为:0、2、4、8、12、16、20 I,zg/mL。在516 nm处测定 上述标准系列溶液的吸光度,绘制标准曲线。 1.2.3紫红薯色素的提取与精制 1 l O 0 前期研究结果和相关报道 都表明,超声波功率 ●2 2,2 0● 4 4 6 5 对花色苷类色素提取效果的影响较小,故选择250 W 的超声波辅助下,以浸提时间、料液比、浸提温度、浸提 液酸碱度4因素3水平设计正交试验k(3 )(单因素水 平为前期研究结果),见表1。 表1正交试验因素、水平表 (3 ) Table 1 Orthogonal factors,the levels of table L9(3 ) 以色素特征吸收波长324 nm处吸光度为考察指 标,极差分析各因素影响效果,优化提取工艺,结果见 表2。结果表明,超声辅助下提取紫红薯色素时,提取 液酸碱度对提取效率的影响最大,其次是温度因素,而 超声浸提时问对试验结果的影响最小,四因素影响顺 序依次为D>C>B>A,最佳工艺组合为A,B c,D ,即 250 W超声辅助下提取紫红薯色素的最佳工艺为:以 pH为1的蒸馏水为提取剂,料液比为1:100,提取温度 为70℃,提取时间为35 arin。 表2正交试验法优选紫红薯色素提取工艺参数 Table 2 Orthogonai purple sweet potato pigment extraction parameters A B D 一 1 l 3 0.284 1 2 0.400 l 3 0.360 2 1 0.394 2 2 0.373 2 3 0.246 3 l O_351 3 2 O.3l6 3 3 0.390 1.044 1.029 1.049 K2 1.Ol3 1.089 0.920 K3 1.057 0.996 1.146 k1 0.348 0.343 0.350 k2 0.338 0.363 0.307 k3 0.352 0.332 0.382 R O.031 0.075 提取液经减压浓缩、喷雾干燥,得到提取物粉末 粗品131。粗品加适量酸性水溶解后过滤,滤液在室温下 以2.0 mUmin经过x一5大孑L吸附树脂柱(内径1.2 cm, 柱高10 cm),以60%乙醇作为解吸剂,洗脱,解脱液再 次树脂吸附精制。如此重复4次151。 凝胶过滤层析法进一步精制。过滤层析柱内径 1.0 cm,柱高50 cm,柱内装40 cm高SephadexG一50凝 胶悬浮液,O O O 勰胶面加一层滤纸以保护胶面,以3个柱床体 l 积的蒸馏水平衡凝胶柱。将经x一5大孑L吸附树脂法精 2 ¨ 3 制的色素溶液分批上柱,样品进入凝胶床后,以酸性蒸 馏水为洗脱剂,1.5 mL/min流速洗脱,洗脱液收集,经 浓缩、真空干燥得到较高纯度的紫红薯色素。 1.2.4 自由基残留率的测定 取适量精制紫红薯色素,以无水乙醇为溶剂,配 制不同浓度的紫红薯色素乙醇溶液,分别取0.5 mL样 液,加入4.5 mL质量浓度为2xlO mg/mL DPPH标准 液,摇匀。516 nm处动态测定混合物在不同时间的吸 光度,根据标准曲线得到DPPH・残留量。以不同浓度 样液测得的结果得到紫红薯色素清除自由基能力与色 素浓度的关系。 按以上方法,测定不同浓度的V 和芦丁清除 DPPH・的效果。 1.2.5半抑制量的计算与清除自由基能力评价 DPPH・自由基的起始浓度减少至50%时紫红薯 色素、V 和芦丁的添加量,即为半抑制量(EG∞)。依据 以下公式计算紫红薯色素、v 和芦丁各自的自由基清 除能力A E(Antiradical efifciency)。 —:==134 AE=I/E 第3詈 1卷第1期 食品研究与开K明 -乃.J,蹑 T发 检测分析 根据AE的大小判断抗氧化剂清除自由基能力的 大小,AE越大,其清除自由基能力越强。 2结果与分析 2.1 DPPH・在516 nm处的标准曲线 分光光度法测定DPPH・标准系列溶液在516 nm 处的吸光度值,结果见图1,作线性回归分析,得到其 时间 ̄rain 图3 vc不同添加量清除自由基效果 线性回归方程为:Y=39.109 5 +O.375 9,相关系数r= 0.999 5,相关系数r显著性T检验法结果:ro.。。=0.874, Irl>roo.。,表明DPPH・浓度与其吸光度呈极显著正相关 关系。 2.2紫红薯色素、V 、芦丁浓度与清除自由基效果的 关系 蚕3 、瓣盟 3加 ∞釉∞∞加0 O 0 5 10 15 20 25 浓度,f 暑,nlL) 豳1 DPPH・标准曲线 Fig.1 The standard CHIVe of DPPH‘ 分别将不同浓度的紫红薯色素、V 和芦丁与 DPPH・作用,516 nm处测定混合物在不同时间的吸光 度,根据2.1得到的标准曲线换算出不同时间时 DPPH・的残留质量浓度,继而由下列公式计算出 DPPH・的残留率。 DPPH・残留率=[DPPH・】 ̄[DPPH・]T=OX1O0% 式中:fDPPH・}r为某一时刻DPPH・的质量浓度; (DPPH・ 为DPPH・的起始质量浓度。 图2、图3、图4分别为紫红薯色素、v 和芦丁的 添加量与DPPH・残留率之间的关系。 试验结果表明,紫红薯提取色素、 、芦丁都具有 岩兰奢萍嚣-一-O-- 15~L 曼6鼬4 ∞ 0LIlllg/I0m…g/II1m ̄.O0 I!.■■—■●◆_!—H 州◆_◆_.HH ;o… g“ … / L 20.O0} 0‘O0 —— —— —一0 时间/min 清除DPPH・自由基的能力,具有一定的抗氧化活性, 而且,随抗氧化成分量的增加,清除自由基能力也增 强。不同的是,三者清除DPPH・自由基的速度有较大 Fig.3 Add a diferent amount ofVcto removethe effect offree radicals 谆 汪 Z 0 时J日1J/min 图4芦丁不同添加■清除自由基效果 Fig.4 Add a diferent amount of rutinto clearfree radicals effect 差异,其中V 清除速度最快,几乎在1 min之内 DPPH・自由基残留率就趋于稳定,表明其清除自由基 速度很快,为快速抗氧化剂;紫红薯提取色素虽然清除 DPPH・自由基的速度比v 慢了许多,但可以看出,其 含量相对比较高时清除速度也相对较快,在5 rain左 右DPPH・自由基残留率趋于稳定,为中速抗氧化剂; 芦丁清除DPPH・自由基速度相对较慢,在10 min左右 DPPH・自由基残留率趋于稳定,为慢速抗氧化剂。 2.3紫红薯色素半抑制量及其清除自由基能力分析 当DPPH・残留率为50%时的抗氧化剂添加量即 为半抑制量(Ec蛐),紫红薯色素、V 和芦丁的半抑制量 见表3。 试验结果表明,紫红薯提取色素抗氧化、清除自 表3紫红薯色素、V 和芦丁的半抑制量值 Table 3 The semi-Money of purple sweet potato pigment,Vc and rutin inhibit 由基能力介于vc与芦丁之间,具有一定的抗氧化活 性,紫心红薯贮藏能力强于普通红薯,原因就是因为紫 心红薯中含有具有抗氧化活性的紫色素,紫红薯色素 主要成分为酰基化花青素类,其含有的酚羟基能有效 终止自由基链式反应。另一方面,由于部分羟基被咖啡 酸、阿魏酸或对羟基苯甲酸等芳香酸酰化[6t,形成花色 苷,在一定程度上影响了其抗氧化能力,所以表现出与 检测分析 食品研究与开发 第32011卷第1期 0年1月 135 牛奶中黄曲霉毒素的放射免疫法检测 闰磊,李卓。张燕 (天津市乳品食品监测中心,天津300381) 摘要:探讨应用CharmlI放射免疫分析方法检测牛奶样品中黄曲霉毒素。确定检测的样品制备和控制点设定的方 法,评价免疫反应体系的灵敏度和精密度,验证《中华人民共和国国家标准灭茵乳》GB 5408.2—1999中牛奶黄曲霉毒 素最大检出量(0.5 ixg/kg)的检测稳定性。 关键词:CharmII放射免疫法;黄曲霉毒素;牛奶 Aflatoxins in Milk by Radio Inununoassay Method YAN Lei,LI Zhuo,ZHANG Yan (Dairy Food Monitoring Center,Tianjin Nankai District,Tianjin 300381,China) Abstract:To discuss the application of Charm 11 Radioimmunoassay used to detect Aflatoxin in milk samples. Determine the detection and control of sample preparation method of setting,evaluation of the immune response system sensitivity and accuracy,the certiifcation requirements of the(The People s Republic of China Nationel Standard Starilized milk>GB 5408.2-1 999 milk Aflatoxin detection volume of the largest(0.5 ̄g/kg)stability test sexua1. Key words:Charm II Radioimmunoassay method;aflatoxins;milk 黄曲霉毒素M (Aflatoxins M ,AFM。)是动物摄入 黄曲霉毒素B,(Aflatoxins B ,AFB。)后在体内经羟基化 素B 的饲料后,其奶中即有M。排出。它是一种强致癌 物质,毒性仅次于AFB ,急性毒性与AFB。相似,即使 食品中含量非常少,通过生物积累也能引起人体癌变。 WHO将其列为liB类致癌物。根据欧盟EC1881/2006 形成的代谢物。1963年Allerofl首先在羊奶中发现, 1965年命名为AFM。,牛羊等动物食人含有黄曲霉毒 作者简介:闫磊(1982一),男(汉),助理工程师.本科,研究方向:乳 制品和食品中营养成分、加工添加成分及农兽药残留的检测 ◆◆◆●●●●●●●●●◆◆●●●●●●◆◆●●◆的规定黄曲霉毒素M 在牛奶中的最高残留量是 0.05 Ixg/kg;我国黄曲霉毒素M 在牛奶中的最高残留 量是0.5 I,zg/kg。 ◆●●●◆◆◆●◆◆◆●●◆●●●◆◆●●◆● V 相比的一定差距。 【2】徐亚明,赵晓燕,马越,等.紫甘蓝色素抗氧化能力的研究【J1_食 品研究与开发,2006,27(11):59—62 2.4结论 通过DPPH法能有效测定紫红薯色素抗氧化、清 除自由基的能力。结果表明,随着紫红薯色素浓度的 增大,其抗氧化能力也相应提高。与V 和芦丁比较,紫 红薯色素抗氧化、除自由基能力低于V ,但略高于芦 丁。紫红薯色素清除DPPH自由基的半抑制量为 163 mg/mL,其清除自由基能力4E为0.006 1。 参考文献: [1】吕丽爽.天然抗氧化剂低聚原花青素的研究进展『J1_食品科学, 2002.23(2):147一l49 f31茹宗玲,李安林,张换平.超声波提取月季花红色素的工艺研究 IJ1.食品研究与开发,2007,28(8):56—58 【4】杨永利,郭守军,彭成圆,等.超声波辅助提取潮州柑果皮色素 的工艺优化lJI.食品科学,2006,27(12):487—489 【51李春阳,许时婴,王璋.DPPH法测定葡萄籽原花青素清除自由 基的能力『J1_食品与生物技术学报,2006,25(2):102—106 [6]杨贤松,杨占苗,高峰.紫色甘薯色素的研究进展叨.中国农学通 报,2006,22(4):912—916 收稿日期:2009—03—19