焦化废水处理中酚降解细菌的分离及降解特性的初步研究
2021-10-04
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第23卷第2期 安徽冶金科技职业学院学报 V01.23.No.2 2013年4月 Joumal of Anhui Vocational College of Metallurgy and Technology Apr.2013 焦化废水处理中酚降解细菌的分离 及降解特性的初步研究 相 宜 (中冶华天工程技术有限公司 安徽马鞍山243000) 摘 要:通过对合肥四方化肥厂曝气池和沉淀池中活性污泥的处理,进行菌种分离、筛选、鉴定,以及测定phen一10菌株 的酚降解能力,旨在找到一些对酚处理效果好的优势菌株,并记录优势菌株的最佳生长条件,为今后的进一步研究提供依 据。 关键词:焦化废水;酚降解;细茵;分离;优势茵株 中图分类号:X784文献标识码:A文章编号:1672—9994(2013)02—0047—05 焦化废水是含芳香族化合物和杂环化合物的 按富集培养基的组成成分要求准确称取各物 典型废水,焦化废水中苯酚类及苯类属易降解有机 质,然后将上列物质混合后加蒸馏水200 ml,煮沸 物,吡咯、萘等属于可降解有机物,吡啶、咔唑等属 至琼脂完全溶解。注意,在加热过程中,要不断的 于难降解有机物。含有的主要有机物苯酚、喹啉、 搅拌。待煮沸后再加入300 ml的蒸馏水,煮沸。 苯类、吡啶、吲哚、萘等类别众多而且含量差别很 将配制好的富集培养基冷却一会儿,然后将其转移 大,苯酚类及其衍生物占很大的比例。焦化厂的酚 至500 ml的已灭菌的三角烧瓶中,用棉塞塞住瓶 类物质主要是低级一元份酚,沸点在230"C以下, 口,并用牛皮纸包好,放人高压灭菌锅,以121℃ 故称之挥发酚。它们是由烟煤大分子结构在炼焦 (O.1MPa)灭菌20 min。灭菌结束后,取出培养基。 热解过程中形成的。一种情况是烟煤大分子结构 冷却后,分别向已灭菌的培养皿中加人lO m1一l5 上的含酚基团在热解过程中断裂脱落,经碳化室的 ml的培养基,待其凝固后备用。 氢还原而成。另一种情况是荒煤气中所含的醌类 (2)琼脂平板:牛肉浸膏5,蛋白胨10,氯化钠 物质在碳化室内被氢还原成酚。酚污染的途径主 5,琼脂2O,苯酚400 mg/L。 要是通过荒煤气的泄露及扩散,酚水息焦,蒸氨废 按琼脂平板培养基的组成成分要求准确称取 水,粗苯分离水,焦油系统精制过程中的洗涤水,分 各物质,然后将上列物质混合后加蒸馏水200 ml, 离水等。 煮沸至琼脂完全溶解。注意,在加热过程中,要不 1材料与方法 断的搅拌。待煮沸后再加入300 ml的蒸馏水,煮 沸。将配制好的琼脂平板培养基冷却一会儿,然后 1.1实验材料 将其转移至500 ml的已灭菌的三角烧瓶中,用棉 1.1.1样品合肥四方集团焦化污水处理厂曝气 塞塞住瓶口,并用牛皮纸包好,放人高压灭菌锅,以 池和沉淀池中的活性污泥。 121℃(0.1 MPa)灭菌20 min。灭菌结束后,取出 1.1.2苯酚上海化学试剂有限公司生产。 培养基。待培养基冷却一会后,将其以无菌操作倒 1.1.3培养基(组分g/1) 人已灭菌的培养皿内。加盖,在平桌上转动,凝固 (1)富集培养基:牛肉浸膏5,蛋白胨l0,氯化 后即成所需的平板(转动时要轻,否则培养基会溢 钠5,琼脂18,pH 7.4—7.6。 出。另,在将培养基倒人无菌培养皿后也可不转 动,待其凝固后也是平板。)。 收稿日期:2o12—11一lO 作者简介:相宜(1985一),男,中冶华天工程技术有限公司,工程 (3)斜面培养基:蛋白脉5,酵母膏5,葡萄糖 师。 1,琼脂20,K2HPO41,pH 7.4—7.6。 ・48・ 安徽冶金科技职业学院学报 2013年第2期 按斜面培养基的组成成分要求准确称取各物 质,然后将上列物质混合后加蒸馏水200 ml,煮沸 至琼脂完全溶解。注意,在加热过程中,要不断的 膏3g蛋白胨10g硫酸亚铁0.2g Nacl 5g硫代硫酸 钠0.3g琼脂12g蒸馏水1000ml 搅拌。待煮沸后再加入300 ml的蒸馏水,煮沸。 将配制好的斜面培养基冷却一会儿,然后将其转移 至500 ml的已灭菌的三角烧瓶中,用棉塞塞住瓶 口,并用牛皮纸包好,放人高压灭菌锅,以115℃ (0.05 MPa)灭菌20 min。灭菌结束后,取出培养 基,将其转移至20个已灭菌的试管里(可用胶头 (10)牛肉膏蛋白胨液体培养基: 其培养基成分与牛肉膏蛋白胨培养基相同,但 不加琼脂,蛋白胨的质量要检查,在试管中加入少 量蛋白胨和水,然后加几滴奈氏试剂,如无黄色沉 淀,则可以使用,若有则不能使用。 (11)硝酸盐还原试验培养基: 蛋白胨lg NaC10.5g KNO30.1 g一0.2 g蒸馏 水100 ml pH7.4在0.10 MPa下灭菌20 min,KNO 需要用分析纯试剂,装培养基的器皿需特别洁净。 格里斯试剂:A液,对氨基苯磺酸0.5g 10%稀 醋酸150ml;B液,a一萘胺0.1g蒸馏水20ml 10% 稀醋酸150ml。 滴管采用悬滴的方式转移,转移的过程中要使培养 基直接滴入试管内,不可玷污上段管壁,并要避免 浸湿棉塞。每只试管内装入的量大约为试管高度 的1/3)。然后将试管搁置在木条或木棒上,使试 管呈适当的斜度(切勿倾斜过度,以免培养基玷污 棉塞)。待培养基凝固后即成斜面。 (4)唯一碳源培养基:以KH PO 0.5, K2HPO4 0.5,MgSO4・7H20 0.2,CaC12 0.1,NaC1 (12)柠檬酸盐斜面培养基:柠檬酸钠0.2g K2HP04 0.05g NH4N03 0.2g琼脂1.5—2g蒸馏 水100ml 1%溴麝香草酚蓝(酒精液)lml 1.1.4实验药品及器皿 0.2,MnSO4・H20微量,FeC12 10%微量, NH4NO31.0为溶剂配制成含苯酚100 mg/L一 1000 mg/L的培养基。 按唯一碳源培养基的组成成分要求(每一个 浓度)准确称取各物质,然后将上列物质t昆合后加 蒸馏水200 ml,煮沸。注意,在加热过程中,要不断 的搅拌。待煮沸后再加入300 ml的蒸馏水,煮沸。 将配制好的唯一碳源培养基冷却一会儿,然后将其 转移至500 ml的已灭菌的三角烧瓶中,用棉塞塞 住瓶口,并用牛皮纸包好,放人高压灭菌锅,以 121℃(O.1 MPa)灭菌20 min。灭菌结束后,取出 草酸铵结晶紫染液革氏碘液番红染液过氧 化氢杜氏发酵管路哥氏碘液,无菌培养皿等。 1.2实验方法 1.2.1菌种的初筛 将新取的合肥四方集团焦化污水处理厂的活 性污泥在空气中曝气24 h。取5 mL活性污泥,加 水50ml制成菌悬液,并依次制备稀释倍数分别为 10倍、100倍、1000倍的菌悬液。 分别吸取0.1ml的不同稀释倍数的菌悬液于 富集培养基上,用接种棒涂布均匀,贴上标签,倒置 于30%的生化培养箱中培养2天,并观察其长势。 每一个稀释倍数至少做一个平行样。 以无菌操作,右手持经烧灼灭菌冷却后的接种 环从富集培养基中取一环菌种,同时左手持琼脂平 板培养皿,以中指,无名指和小指托住皿底,拇指和 培养基。待培养基冷却一会后,将其转移至100 ml 的三角烧瓶中(每个l5 ml。转移过程中要注意不 要玷污瓶口)。 (5)含有淀粉的牛肉膏蛋白胨培养基(15 ml/ 管):培养基在配制时应先把淀粉用少量蒸馏水调 成糊状,再加到融化好的培养基中,在0.10 MPa下 灭菌20 min。 食指夹住皿盖稍倾斜,左手拇指和食指将皿盖掀起 一些,右手把接种环伸人培养皿,将一环菌种在平 (6)明胶液化培养基:培养基成分与牛肉膏蛋 白胨培养基相同,但凝固剂改用明胶。 (7)葡萄糖蛋白胨培养基:葡萄糖0.5g.蛋白 胨0.5g.K2HPO4 0.5 g,蒸馏水100 ml (8)蛋白胨水培养基:蛋白胨1g NaC1 0.5g蒸 馏水100ml 板表面轻轻的划线,划线为平行线,划线后,将皿盖 盖好,倒置培养皿于3O。【=恒温箱内培养24h。 以无菌操作,用经烧灼灭菌冷却后的接种针在 琼脂平板中取一环菌种,取出少许,慢慢将接种针 抽出试管,接种针抽出时不要使针头部分碰到管壁 和管口,取出后,不可使针头通过火焰,更不可触及 其它无关物品或桌面迅速将接种针伸进另一试管, (9)硫酸亚铁琼脂培养基:牛肉膏3g酵母浸 总第59期 相宜:焦化废水处理中酚降解细菌的分离及降解特性的初步研究 。49・ 在培养基上轻轻划线,接种菌体于其上。划线时, 要由底部起划较密的平行线,一直划到顶部,以充 分利用斜面面积,但不要将培养基划破。在所有菌 转培养皿,使碘液铺满全皿为度,若菌落周围出现 无色透明圈,说明淀粉被水解,透明圈的大小,说明 该菌水解淀粉能力的大小,反之则表示该菌不产淀 粉酶,无水解淀粉的能力。 (2)明胶液化实验 株接种完后,将它们放人30%的生化培养箱中培 养1 d,并观察其长势。然后将其放人4 ̄C的冰箱 内存放备用(斜面培养基要在7 d左右进行菌株的 用穿刺法将菌种接种于明胶培养基试管中,20 复壮)。 1.2.2菌种的复筛 以无菌操作将备用的菌株制备成菌悬液,吸取 0.1 ml涂布于富集培养基上,倒置于30℃生物培 养箱中培养2 d。 以无菌操作制备phen一5的菌悬液,依次吸取 lml的菌悬液分别滴人含酚200mg/l、400rag/l、 600mg/l、800mg/1.1000mg/l的唯一碳源培养基各 15 ml的100 ml三角瓶中,在3Ooif、200 r/min下摇 床培养24 h,记录为phen一5—200,phen一5—400, phen一5—600,phen一5—800,phen一5—1000;其 余菌种按照步骤同样接种。 测定各培养瓶内酚含量。经生物降解实验后 筛选出5株具有高效降解酚能力的菌株。 1.2.3细菌生长量测定 用光程10 mm比色皿,以空白培养基作对照, 在600 nm波长下测菌悬液的光密度值(OD600)。 菌悬液的浓度与光密度值成正比,光密度值大者可 以认为其生长情况较好。 1.2.4苯酚含量的测定 本实验采用改进的4一氨基安替吡啉法测苯 酚的含量:培养液以7500 r/min离心10 min,取上 清液100txL装人到10 mL的试管中,加5 ml蒸馏 水和100txl 0.5 mol/1的NH3・H20溶液,用pH 6. 8的磷酸盐缓冲液调pH=7.2,加5O l体积分数 2%的4一氨基安替吡啉,混匀,再加人501 ̄1的铁 氰化钾溶液,混匀,静置15 min,在510 nm波长处 测吸光度。 1.2.5菌株鉴定 根据细菌的菌落特征、个体形态、生理生化反 应,进行初步鉴定。 (1)淀粉水解实验 取已融化并保温在50 ̄C的培养基制成平板, 无菌操作用接种针挑取菌种少许,等距排布点接种 于同一平板,重复两皿,做好标记28℃,培养2 d一 4 d。形成菌落后,于平板上滴加碘液数滴,轻轻旋 ℃培养48 h,观察培养基是否液化,如细菌在此温 度下不能生长,则必须在所需的最适温度下培养1 d一3 d,观察结果时要将试管从温箱里取出,置于 冰浴式冰箱中,30 min后即倾斜试管,如试管中培 养基部分或全部呈液化状态,表明试管中菌种为阳 性,否则为阴性。 (3)甲基红试验(MR) 接种待鉴定的菌株于葡萄糖蛋白胨培养基试 管中,另取一支相同的培养基不接种作为空白对 照,置于37%培养一天。观察结果时,沿试管壁向 培养基中加入甲基红(M.R.)试剂5—6滴,呈鲜 红色的为甲基红(M.R.)试验阳性,呈橘红色的为 弱阳性,呈橘黄色的为阴性。 (4)吲哚试验 接种试验菌种于蛋白胨水培养基试管中,另取 一支试管不接种作为对照,37℃培养24h。观察结 果时,在培养基中加人乙醚1mL形成明显的乙醚 层,充分振荡,使吲哚溶于乙醚,静置片刻,待乙醚 层浮于液面后,再沿试管壁加入吲哚试剂1O滴。 如有吲哚存在,则乙醚曾呈现玫瑰红色,为阳性反 应(加人吲哚试剂后不可再摇动,否则红色不明 显);不呈现红色的为阴性反应。 (5)产硫化氢试验: 用穿刺接种法接种试验菌种于硫酸亚铁琼脂 培养基中,37℃培养2 d一4 d。培养基中有黑色 物质为硫化氢试验阳性,否则为阴性。 (6)产氨试验 接种试验菌于肉膏蛋白胨液体培养基试管中, 另取一支试管不接种的作为对照,37℃培养24 h。 在培养液中加入3—5滴氨试剂,如出现黄色或棕 色沉淀为阳性反应,否则为阴性反应。 (7)硝酸盐还原试验 在对照培养基合格的前提下,将接种过的培养 液分成两试管,其中一支试管按上述方法加人格里 斯氏试剂,如出现红色,则为阳性反应。如不出现 红色,则需在另一试管中加锌粉少许,摇动,加热, ・50・ 安徽冶金科技职业学院学报 2013年第2期 再按上述方法加入格里斯氏试剂,如出现红色,则 mg/l时,phen一10菌株的生长量最大,接种后24 h 说明培养基中硝酸盐仍存在,此为印行反应;如不 出现红色,则说明硝酸盐已被进一步还原为氨和 氮,应为阳性反应。 苯酚降解率达76%。所以,综上所述:phen一10菌 株在30 ̄(2、pH值为7.0、苯酚浓度为300 mg/l的唯 一碳源培养基中培养,至16 h时苯酚几乎被全部 (8)柠檬酸盐试验 取柠檬酸盐斜面培养基,划线接种,于37 ̄C培 养2—4 d后观察结果。培养基有绿色变为蓝色者 降解,为菌株的最适宜生长条件。 (2)苯酚降解和菌体浓度变化趋势具有一致 性,phen一10菌株的生长情况与苯酚的降解情况 为阳性反应,否则为阴性反应。 (9)格兰氏染色: ①将待鉴定的菌株制成涂片。②用草酸铵结 晶紫染液染1 rain,水洗。③加革氏碘液媒染1 min,水洗。④用95%的乙醇脱色0.5 min,水洗。 ⑤用番红染液复染1 min,水洗。 (10)接触酶试验 用滴管吸取过氧化氢滴加到待鉴定的菌种斜 面内,有气泡产生的为接触酶阳性,否则,为接触酶 阴性。 (11)氧化酶试验 取白色洁净滤纸沾取待鉴定的菌落。加人 1%盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴,阳性者呈现粉 红色,并逐渐加深;再加1%OL一萘酚(酒精)溶液一 滴,阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色,阴性于两分钟 内不变色。 (12)糖发酵试验 将菌种接种与装有糖发酵基础液的杜氏发酵 管,保温培养24、48、72小时后检查。必要时可延 续培养至7天。 2实验结论 (1)温度在25℃一35℃之间,phen一10菌株 生长和降解苯酚比较稳定,其中尤以30℃时最佳, 菌体OD600可达到0.501,酚降解率达65%。25 ℃以下和35℃以上时,菌体生长速度缓慢,苯酚降 解率下降很快。phen一10菌株在pH值为6.0— 7.5时苯酚降解率均在50%以上,在pH值为7.0 时达到62%。在较低pH值时,phen一10菌株生 长缓慢,这是由于强酸作用抑制了phen一10菌株 的生长。在较高pH值时,phen一10菌株的生长受 到抑制,菌体不生长,不能利用苯酚。苯酚浓度在 300 mg/l以下时,该菌能在接种后24 h内大量降 解唯一碳源培养基中的苯酚;当苯酚浓度为300 是同步的。在最初的6 h内,其生长呈缓慢上升趋 势,在6 h一12 h间,菌体浓度OD600值快速上升, 说明此时的phen一10菌株正处在对数生长期,至 12 h一15 h间,phen一10菌株达到最大生长值;与 此相对应的苯酚降解率在菌株将进入对数生长期 时,开始快速升高,至15 h时达到73%。之后,从 16 h开始,由于苯酚(唯一碳源)等营养成分被大 量或完全降解,phen一10菌株进人衰退期,菌体浓 度OD600值开始下降。利用菌体浓度(OD600)变 化来筛选优势菌株是一种简单可行的方法。 参考文献 [1] 凌琪,汤利华,陶勇等.苯酚降解细菌的分离与选育 研究[J].中国给水排水,2007,23(11)78:一82. 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Key words: Coking wastewater;phenol degradation;bacteria;separation;predominant strains (上接第39页) 过F6导水断层,实现主、副井与风井安全准确贯 通。通过几个月来对F6导水断层巷道的密切观 (2)开挖检查:帷幕灌浆结束14天后,巷道或 察,未发现任何安全隐患,效果良好。 采矿开挖穿越灌浆区时,观测漏水量的情况。 参考文献 4结语 [1] 崔云龙.简明建井工程手册[M].北京:煤炭工业出 (1)F6导水断层防渗灌浆孔布置合理,对断层 版社,20o3 全断面注浆形成帷幕,并能加固围岩。(1)60无缝钢 [2] 中国矿业大学.井巷设计与施工[M].徐州:中国矿 管既能作为最后灌段的射浆管使用,又可在巷道开 业大学出版社,2O04 挖时,起到超前管棚支护作用。 [3] 董亚宁等.断层突水定向造斜注浆技术的应用[M]. (2)内循环灌浆法,既能对已钻孔段的破碎岩 现代矿业,2010 体进行反复注浆加固,又能根据孔内情况对涌水实 [4] 甘晓平.丰富地下水情况下人工挖孔桩扩底处理 [J].安徽冶金科技职业学院学报,2012.4 施随时注浆准备。 (3)2012年9月15日,白象山铁矿已成功通 Comprehensive Treatment Technology of Interception and Seepage Prevention for Complex Rich——water Fault D0NG Ya—ning Abstract:Through comprehensive analysis of hydrogeology to F6 fault of wind well of baixiangs. hart iron ore at level一470m,the comprehensive treatment technology of interception and seepage pre— vention for complex rich—water fault was put forward,and the complex rich—water fault was passed reliably and safely. Key words: sudden inflow of water;fault;interception;grunting