一株苯酚降解菌的筛选及其降解性能研究

一株苯酚降解菌的筛选及其降解性能研究　付玲玲　（鞍山市千山区环境保护局，辽宁鞍山１１４０００）　摘要：从本溪市桌焦化厂的活性污泥中分离驯化得到一株高效苯酚降解茵ｃ１，初步鉴定为假单胞茵。该茵能在以苯酚为　唯一碳源的无机盐培养基中生长，且最高可耐受２　０００ｍｓ／Ｌ的苯酚。对该茵降解性能研究表明，该茵具有较强的苯酚降解能力，　在苯酚浓度为４００　ｍｇ／Ｌ、３０　ｏＣ、ｐＨ值７．Ｏ、摇床转速１２０　ｒ／ｍｉｎ、接种量５％的条件下，培养２４　ｈ后苯酚降解率可达９９％以上。葡萄　糖对该茵体的生长及苯酚降解能力均有一定的影响；低浓度（＜０．５　ｓ／Ｌ）葡萄糖可以提高该茵对苯酚的降解速率。　关键词：苯酚降解茵；驯化；苯酚；生物降解　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｓｔｒａｉｎ　Ｃ　ｌ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｐｈｅｎｏｌ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ，ｗｈｉｃｈ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｓｌｕｄｇｅ　ｏｆ　ａ　ｃｏｋｅ—ｐｌａｎｔ　ｆａｃｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｅｎｘｉ　ａｎｄ　ｔｅｎｔａｔｉｖｅｌｙ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ　ａｓ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．Ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎ　ｗａｓ　ａｂｌｅ　ｔｏ　ｇｒｏｗ　ｉｎ　ｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｉｔｈ　ｐｈｅｎｏｌ　ａｓ　ｓｏｌｅ　ｃａｒｂｏｎ　ＳＯＵｒＣｅＳ，ａｎｄ　ｉｔ　ｃｏｕｌｄ　ｒｅｓｉｓｔ　ｔｏ　ｐｈｅｎｏｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｕｐ　ｔｏ　２　０００　ｍｇ／Ｌ．Ｔｈｅ　ｐｒｅｌｉｍｉ—　ｎａｒｙ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎ　Ｃ　１　ｈａｄ　ｓｔｒｏｎｇ　ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ａｆｔｅｒ　２４　ｈ。ｔｈｅ　ｐｈｅｎｏｌ　ｗｉｔｈ　ａ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　４００　ｍ￣＿／Ｌ　ｗａｓ　ｄｅｇｒａｄｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎ　ａｂｏｖｅ　９９％ａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　３０。Ｃ，ｐＨ　７．０，ｔｈｅ　ｑｕａｎｔｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　５％，ｃｏｎ—　ＣＵＳＳ　ｓｐｅｅｄ　ｏｆ　ｓｈａｋｅ　ｂｅｄ　１　２０　ｄｍｉｎ．Ｇｌｕｃｏｓｅ　ｈａｄ　ｓｏｍｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ　ｆｏｒ　ｐｈｅｎｏ１．Ｔｈｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｐｈｅｎｏｌ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｗａｓ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ａｔ　ｌｅｓｓ　ｔｈａｎ　０．５　ｇ／Ｌ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｈｅｎｏｌ　ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ；ａｃｃｌｉｍａｔｉｚａｔｉｏｎ；ｐｈｅｎｏｌ；ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ；　中图分类号：Ｘ７０３　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７４—１０２１（２０１４）０８—００４５—０３　１　引言　性污泥中分离得到。　２＿２培养基　苯酚是树脂制造、炼油、焦碳、染料、纺织、农药　和医药生产等工业废水中的主要污染物，在水体中，　无机盐培养液是在无机盐溶液中添加一定量　５～２５　ｍｇ／Ｌ的苯酚即可对鱼类的生存构成威胁　１］。苯　的苯酚配成，各种无机盐的含量　为：ＫＨ２Ｐ０４０．５　ｇ／Ｌ，　酚被美国环境保护署列入优先控制污染物和６５种　ＫｚＨＰ０４０．５　ｅｌＬ，ＭｇＳ０４。７ＨｚＯ０．２　ｇ／Ｌ，ＣａＣｌｚ０．１　ｇ／Ｌ，ＮａＣ１　有毒污染物名单，也是我国优先控制污染物之一　］，　０－２　ｇ／Ｌ，ＭｎＳ０４＂Ｈ　０微量，ＦｅＣ１　微量（质量分数为ｌＯ％），　因此，含酚工业废水的治理具有重大的意义。除了传　ＮＨ４Ｎ０３１．０ｇ／Ｌ，ｐＨ７．０￣７．２。　统的理化方法外，用微生物降解苯酚是一种经济有　琼脂平板培养基的配制如下：牛肉膏５．０ｇ／Ｌ，蛋白　效且无二次污染的方法，许多学者在这方面进行了　胨　１０．０　ｇ／Ｌ，氯化钠５．０　ｇ／Ｌ，琼脂２０．０　ｇ／Ｌ，苯酚１．０　ｇ／Ｌ，　大量研究［３－６ｊ。已鉴定具有降解苯酚能力的微生物有　细菌、酵母菌等。本实验从某焦化废水处理曝气池的　ｐＨ７．０－７．２。　活性污泥中分离出一株苯酚降解菌Ｃ１，经初步鉴定　２．３苯酚降解茵的驯化、筛选与分离　为假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．），通过研究菌株Ｃｌ的　降解苯酚菌的驯化采用定时逐渐加量的方法。　生长条件及降解特性，期望能为含苯酚类污染物的　取污泥５　ｍＬ加到盛有５０　ｍＬ含酚浓度为５００　ｍｇ／Ｌ　废水生化处理提供借鉴。　的无机盐培养液的２５０　ｍＬ三角瓶中，在３Ｏ℃，　２材料与方法　ｐＨ７．０　７．２，１２０　ｒ／ｍｉｎ的条件下连续振荡培养２４　ｈ。　然后从中取５％的培养液转接到未接种的同一苯酚　２．１　菌种来源　浓度的无机盐培养基中。连续驯化８　ｄ左右，苯酚浓　从本溪市某焦化厂废水处理系统曝气池中的活　度从５００　ｍｇ／Ｌ增至２　０００　ｍ＃Ｌ。定时取样，采用稀释　收稿日期：２０１４—０６—１７；修订日期：２０１４—０８—０５。　作者简介：付玲玲，女，１９８４年生，工程师，研究生，主要从事建设项目环境影响评价审批工作。　涂布和划线的方法，在分离培养基平板上分离筛选　以苯酚为唯一碳源的苯酚降解菌株ｃｌ。　２．４测定方法　菌体生长以波长为３８０　ｎｍ处的光吸收值（ＯＤ　值）表示；苯酚含量测定［副采用４一氨基安替比啉分　光光度法。　２．５菌株的鉴定　将筛选到的Ｃ１菌株根据文献［　］鉴定至属。　２．６苯酚降解菌降解性能的测定　主要考察苯酚初始浓度、ｐＨ、温度、溶解氧、外　加碳源对菌株Ｃ　１的生长和降解性能的影响。本次实　验均在２５０　ｍＬ锥形瓶中进行。将处于对数生长期的　菌悬液２．５　ｍＬ接种在５０　ｍＬ苯酚浓度为４００　ｍｇ／Ｌ　的无机盐培养基中，以初始培养基（未接菌悬液时）　为空白参比，用稀ＨＣＩ和ＮａＯＨ调节培养液初始ｐＨ　为７．０～７．２，在３０℃，１２０　ｒ／ｍｉｎ的摇床上振荡培养一定　时间后，测定菌体浓度ＯＤ３ｓｏ值及其苯酚降解率。　３结果与讨论　３．１　苯酚降解菌Ｃ１的初步鉴定　细菌的菌落特征为乳白色，圆形突起，不透明，　边缘整齐。单个细胞呈杆状，有运动性。生理生化特　性见表１。根据细菌鉴定及分类方法，初步鉴定Ｃ１　为假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）。　表１　菌株Ｃ１的生理生化特征鉴定结果　革兰氏过氧化氢淀粉水解Ｍ・Ｒ　Ｖ・Ｐ明胶液化葡萄糖　染色　实验　实验　实验实验　实验　发酵　一　＋　－４－　＋　一　－４－　＋　注：＋表示阳性，一表示阴性。　３．２各种因素对菌株Ｃ１的生长及苯酚降解能力的影响　３．２．１苯酚初始浓度对菌株Ｃ１的影响　调节苯酚初始浓度分别为２００，３００，４００，５００，　６００，７００，８００　ｍｇ／Ｌ，其他条件同２．６，分别测定１２　ｈ和　２４　ｈ后培养基中的菌体浓度ＯＤ值及其苯酚降解率。　苯酚初始浓度对菌株Ｃｌ的影响见图１。　＋１２　ｈ降解率　—・一２４ｈ降解率　１．２　１．０　０．８　０．６　Ｓ　０．４吕　０．２　０．０　苯酚初始浓度／（ｍｇ・Ｌ。。）　图１苯酚初始浓度对菌株Ｃ１的影响　由图１可以看出，苯酚初始浓度对菌株Ｃ１的　生长繁殖及降解苯酚的性能影响较大。当苯酚初　始浓度低于４００　ｍｇ／Ｌ时，无论１２　ｈ还是２４　ｈ之　内，菌体生长均随苯酚初始浓度的增加而迅速增　加，而苯酚降解率则缓慢下降（由苯酚浓度的增加　所致），但在２４　ｈ内均可达９６％以上；当浓度超过　５００　ｍｇ／Ｌ时，降酚率及菌浓都呈缓慢下降趋势，菌　体生长受到抑制。２４　ｈ内浓度为８００　ｍｇ／Ｌ的苯酚　降解率仅为２０．４６％，ＯＤ值为０．１２９。由此可以看　出，苯酚对该菌有一定的毒性，高浓度时抑制菌体　的生长和繁殖，影响其对苯酚的降解。同时，该菌　株对苯酚初始浓度在４００　ｍｇ／Ｌ时变化最为敏感，　ＯＤ值达到最大。　３．２．２　ｐＨ值对菌株Ｃ１的影响　调节培养基的ｐＨ值分别为４．０，５．０，６．０，７．０，　８．０，９．０，１０．０，１１．０，其他条件同２．６。２４　ｈ后的测定结　果见图２。　图２　ｐＨ值对菌株Ｃ１的影响　实验结果表明，菌株Ｃ１的生长和苯酚降解率在　ｐＨ６．０～９．０之间比较稳定，说明该菌株在较宽的酸碱　范围内对苯酚有较好的降解，能够很好地适应环境　中的酸碱变化。在ｐＨ为７．０时效果最佳，菌体生长　ＯＤ值为０．９５１，苯酚降解率达９９．１５％，说明该细菌　在中性条件下对苯酚的降解效果最好。　３．２．３温度对菌株Ｃ１的影响　温度影响微生物体内的酶活性，温度过高，会　降低酶的活力；温度过低，对微生物的酶活性也有　很大影响。在ｐＨ为７．０时，调节摇床温度分别为　２０，２５，３０，３５，４０℃，其他条件同２．６。２４　ｈ后测定　的结果见图３。　图３温度对菌株Ｃ１的影响　从图３可以看出，在３０　ｃＩ＝之前，随着温度的升　高，菌株降酚率逐渐升高，菌浓也逐渐增大；在３Ｏ℃　时，其降酚率最大为９９．０７％，此时ＯＤ值为０．９２２；　在３０℃之后，随温度的升高，菌株的生长繁殖活动　减弱，而且其降酚率也逐渐降低。这说明该菌株最佳　的处理温度是３Ｏ℃；实验中发现，在２０℃和４０℃时，　２４　ｈ内的苯酚降解率较低，分别为５３．２７％和　１３．４６％。说明在较低或较高温度下菌株的生长繁殖　能力与降酚能力均较差。　３．２．４溶解氧对菌株ｃ１的影响　溶解氧是好氧微生物生长的重要条件。本实验　分别采用厌氧、静止及不同摇床转速的条件下，其他　条件同２．６。对菌株Ｃ１培养２４　ｈ，其中厌氧过程通过　添加液体石蜡来实现。溶解氧对菌株Ｃ　１的影响见图４。　ｌ（）ｏ　１．２　８０　１．０　Ｏ．８　堡６０　褂　ｏ．６　鲞４ｏ　０　Ｏ．４　２０　Ｏ．２　Ｏ　０．Ｏ　厌氧　静止　５０　ｒ／ｍｉｎ　１２０　ｒ／ａｒｉｎ　１８０　ｒ／ｍｉｎ　不同溶解氧条件　图４溶解氧对菌株Ｃ１的影响　从图４可以看出，厌氧与静止培养２４　ｈ内的苯　酚降解率分别为３５．６１％和５０．６２％，远低于振荡培养　时的降解率，说明菌株ｃ１对苯酚的降解过程为好氧　过程。随着摇床转速的提高，供氧量逐渐增加，苯酚　降解率也随之提高，说明Ｃｌ菌株是好氧菌。另外，从　图４中可以发现，转速分别为１２０　ｒ／ｍｉｎ和１８０　ｒ／ｍｉｎ　时，菌株ｃ１在２４　ｈ内对苯酚的降解率基本相同，分　别为９９．３６％和９９．５２％。说明摇床转速大于１　２０　ｒ／ｍｉｎ　后，降酚率提高有限，考虑动力消耗，摇床转速应为　１２０　ｒ／ｍｉｎ。　３．２．５外加碳源（葡萄糖）对菌株Ｃ１的影响　不同浓度葡萄糖对菌株生长及其苯酚降解能力　的影响见图５。　葡萄糖质量浓度／（ｇ・Ｌ－‘）　图５葡萄糖浓度对菌株Ｃ１的影响　结合图５中１２　ｈ和２４　ｈ内的苯酚降解率可以　看出，当葡萄糖的投量低于０．５　ｇ，Ｌ时，菌浓逐渐增　大，苯酚的降解速率逐渐提高；当浓度超过０．５　ｇ／Ｌ　后，随着葡萄糖浓度的增加，反而使菌株ｃ１的苯酚　降解率下降。在２４　ｈ内，葡萄糖浓度为１，２　ｇ／Ｌ中的　菌株对苯酚的降解率仅为６４．４４％和５５．２５％，远低于　不加葡萄糖时的降解率。这可能是由于苯酚对微生　物有一定毒害作用的影响，使得微生物优先降解葡　萄糖。当投加少量葡萄糖时，促进微生物的生长，从　而提高苯酚降解速率。而葡萄糖浓度较高时，２４　ｈ内　微生物多数以葡萄糖作为碳源生长，导致苯酚降解　效率明显下降。这说明葡萄糖对微生物降解苯酚具　有协同作用和底物竞争关系。　４结论　（１）从本溪市某焦化厂的活性污泥中驯化分离　得到一株以苯酚为唯一碳源的高效苯酚降解菌ｃ１，　初步鉴定为假单胞菌。　（２）对菌株ｃ１降解性能研究表明，在苯酚浓度　为４００　ｍｇ／Ｌ、３０　ｏＣ、ｐＨ值７．０、摇床转速１２０　ｒ／ｍｉｎ、　接种量５％的条件下，培养２４　ｈ后苯酚降解率可达　９９％以上，具有较强的降解能力。　（３）外加碳源（葡萄糖）对菌体的生长及苯酚降　解能力均有一定的影响；低浓度（低于０．５　ｇ／Ｌ）葡萄　（下转７３页）　者在兴城美嘉复合肥有限公司质检部进行了验证实　验。验证实验的条件与表６中第６组实验的条件完　全相同，实验结果见表７。　表７验证实验与原实验结果对比　％　合，表明此方法具有良好的准确度。　（３）改进后，各组实验数据绝对差值均小于０．２０％，　符合ＧＢ／Ｔ　８５７３—２０１０中“平行测定结果的绝对差值　不大于０．２０％”的要求，表明此方法具有良好的精　密度。　（４）改进后，测定操作更加方便快速。　（５）通过在异地进行的验证实验，表明改进后的　方案具有良好的再现性，符合ＧＢ／Ｔ　８５７３—２０１０中　“不同实验室测定结果的绝对差值不大于０．３０％”的　由表７中数据可以看出，验证实验所得数值为　５１．８９％，与在沈阳所做实验数值５１．９６％的绝对差值　为０．０７％，符合ＧＢ／Ｔ　８５７３—２０１０中第７．２条所规定　“不同实验室测定结果的绝对差值不大于０．３０％”的　要求，具有良好的再现性，同时具有良好的准确度和　精密度。　要求。　参考文献　［１］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标　准化管理委员会．复混肥料中有效磷含量的测定（ＧＢ／Ｔ　８５７３—２０１０）Ｉｓ］．北京：中国标准出版社，２０１０．　［２］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标　４结论　本论文研究的目的是探讨取消ＧＢ／Ｔ　８５７３—２０１０　准化管理委员会．复混肥料（复合肥料）（ＧＢ　１５０６３—２００９）　［ｓ］．北京：中国标准出版社，２００９．　［３］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标　中“６．４有效磷的提取”一节规定称样步骤中“称取试　样置于滤纸上，用滤纸包裹试样”的可行性，以及取　消后对实验结果的影响。通过实验得出以下结论：　（１）称样过程中取消用滤纸包裹试样，改为“直　接将样品转移至容量瓶中”可行。　（２）实验结果与优级纯试剂所标明的含量相吻　（上接４７页）　准化管理委员会掺混肥料（ＢＢ　ＪＩ￣）（ＧＢ　２１６３３—２ｏｏ８）［ｓ３．北　京：中国标准出版社，２００８．　［４］辽宁省土壤肥料总站．土壤肥料实验室手册［Ｍ］．沈阳：辽　宁科学技术出版社，２００４．　［５］呼世斌，黄蔷蕾．无机及分析化学［Ｍ］．北京：高等教育出　版社，２００１．　糖可以提高该菌对苯酚的降解速率，而葡萄糖浓度　高于０．５　ｇ／Ｌ时ｃ１菌株的苯酚降解能力明显下降。　ｎｉａｎ　ｓｏｉｌ　ｓａｍｐｌｅｓ［Ｊ］．Ａｒｃｈ．Ｍｉｅｒｏｂｉｏ１．，２０００．１７４：３４６—３５２．　［４］肖利萍，李喜林，于洋，等．优势降酚菌株生长条件的研究　［Ｊ］．科学技术与工程，２００６，２０（１）：３３１４—３３１８．　参考文献　ｌ　１　ＪＤ．Ｋｏｔｒｅｓｈａ，Ｇ．Ｍ．Ｖｉｄｙａｓａｇａｒ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｅｎｏｌ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＭＴＣＣ　４９９６　［５］刘桂萍，刘长风，全桂静．一株苯酚降解菌的分离及降解特　性［Ｊ］．化工进展，２００８，２７（２）：２７９—２８４．　［６］李江，白涛，饶军，等．苯酚高效降解菌的筛选和降解特性　研究［Ｊ］．微生物学通报，２００７，３４（３）：４９２－４９５．　Ｗｏｒｌｄ　Ｊ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ［Ｊ］．２００８，２４：５４１—５４７．　１　２　ＪＢａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ　Ｋ．，Ｄａｓ　Ｄ．，Ｍａｉｔｉ　Ｂ．Ｒ．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｐｈｅｎｏｌ　［７］张月澜，刘桂萍，刘长风．苯酚降解菌ＮＴＺＨ一１的分离筛选　及其降解特性研究［Ｊ］．２００７，２７（３）：１７９—１８１．　［８］国家环境保护局．水和废水监测分析方法［Ｍ］．北京：中国　环境科学出版社，１９９７：４０８－４１０．　［９］东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册［Ｍ］．北京：科学　出版社，２００１：１６２—１７１，６２—６５．　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＭＴＣＣ　１１９４［Ｊ］．Ｂｉｏ—　ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９８，１　８：３７３－３７７．　【３　ＪＡｒｔｕｒ　Ｅｄｕａｒｄｏ　Ｒ　Ｂ，Ｄａｖｉｄ　Ｈ　Ｍ，Ａｎｔｏｎｉｏ　Ｒｏｓｓｉ，ｅｔ　ａ１．Ｓａｌｔ—ｔｏｌ　ｅｒａｎｔ　ｐｈｅｎｏｌ——ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ａｍａｚｏ——