如何利用电镜技术测定病毒粒体的特征?
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发布时间：2022-04-23 07:10
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时间：2022-06-16 19:10
随着科学的发展，电镜已成为一种综合的分析仪器，在植物病毒的诊断和鉴定中发挥着重要作用。植物病毒学上用得较多的是透射电镜。
1 透射电镜的成像原理
显微镜的分辨率与其使用光源的波长呈负相关，即波长越短分辨本领越大。可见光的波长范围为0.4～0.7μm，它决定了光镜的分辨极限为0.2μm，有效放大倍数不能超过2000倍。电镜用的光源为电子*产生的高速电子束，其波长比可见光短十万倍以上，因而大大地提高了分辨率。电镜分辨率接近0.lnm，有效放大倍数在百万倍以上。
在电子显微镜下可观察病毒粒体外形、大小以及在寄主细胞中的位置等。植物病毒粒子常见的有球形、长杆状、线形和弹状。
2 制样技术
样品处理技术多种多样，适用于不同的材料和观察目的。如金属投影和复型技术，主要用于病毒或其他大分子的表面结构和大小观察；冰冻蚀刻用于细胞化学、生物膜等研究；另外还有放射自显影电镜技术、免疫电镜技术等。而植物病毒学上广泛应用的是负染技术和超薄切片技术。负染制样操作简单，所需时间少；而超薄切片制样方法操作复杂，所需时间长，但这种方法可以观察到病毒粒子在组织中的情况。
2.1 负染技术
负染是相对正染而言的。是指在样品的周围包被高电子密度的染料，背景呈深色，而样品呈白色，反衬出样品的轮廓。病毒负染后能很清楚地看到其大小和细微结构。此法简便、易行、快速，为病毒诊断提供了一种可靠手段。现在鉴定病毒，一般先用病汁液做负染观察，根据看到的病毒的大小和形状等，能为进一步研究提供许多有用信息，如采用什么方法提纯、病毒的分类地位如何等。其中有六个病毒属的形态特征非常典型，几乎可以凭此特征就能确定它们属于哪个病毒科、属，见表1。
表1 六个典型特征病毒属
负染的步骤：
制备载膜铜网：在铜网上覆盖一层支持膜，常用0.3%～0.5%福尔瓦（Forvmor）膜（用氯仿配制）。为了加强载膜强度，可以在Forvmor膜上再喷上一层碳膜。
先用载膜铜网吸附样品一至数分钟，病毒浓度低的样品可延长到1h以上，然后去掉多余样品，蒸馏水冲洗数滴去掉部分杂质，然后染色1min左右，去掉多余染料，自然干燥后就可以观察。
注意样品在染色前，尽量不要干燥，否则有些病毒会因干燥而变形或破坏，而醋酸铀等染料能部分固定病毒，减轻干燥对病毒的影响。
在染色和制样中要注意几方面的事项：
（1）取样方法 在负染制样时应该注意寄主特性和病毒在其体内的分布等特性。花叶类型的病株，一般取症状典型的新出叶；而对甜菜黄化病毒组、大麦黄矮病毒组和部分联体病毒组成员，它们都分布在维管束中，维管束的取样和破碎很关键；而线虫传多面体病毒组病毒，植物的各个部位几乎都有分布，种子、分生组织、花粉都可以作为取样的对象。另外寄主种类、发病季节，病株生育期等都能影响实验结果。有些植物体内含有某些特殊的干扰物质，如悬钩子、草莓等植物中含有较高浓度的单宁，木薯、薯蓣叶中含有乳胶，而秋葵、双花扁豆等植物中含有胶质物质，取样时应取它们含量较低的部分，如花器、根等。
（2）适当的抽提方法 有时植株症状很明显，但在电镜下看不到典型的病毒颗粒，这可能是植株体内病毒浓度低，或抽提不充分，或在抽提过程中病毒被降解等原因所致。对浓度低的样品，要加入尽量少的提取液，充分破碎样品，延长抽提时间，加入20%左右氯仿去除色素，低速离心去除大的细胞碎片。有时也可以做一次小样差速离心，浓缩病毒。用PEG沉淀病毒也能起到浓缩病毒作用。对于易破坏的病毒，最好用缓冲液抽提，并加入某些添加剂。常用的有0.01mol/L亚硫酸钠、巯基乙醇、尼古丁等还原剂，蛋白质抑制剂，戊二醛、四氧化锇等固定剂。它们单用或混用。
（3）提纯样品处理 粗提纯或精提纯样品往往含有能和染料起反应的物质，如蔗糖、PEG、PVP、EDTA、氯化铯、硼酸盐、柠檬酸盐等，会产生干扰色，染色前最好用透析等方法除掉它们。
（4）防止样品变形或破坏 病毒在染色和观察中会引起的畸变和破坏，几乎现在已知的染料都能引起某些病毒的破坏作用，如磷钨酸盐对黄瓜花叶病毒属、斐济病毒属、弹状病毒属、等径易变病毒属、联体病毒属、甜菜黄化病毒属的某些成员都具有明显的破坏作用，有时甚至看不到典型的病毒粒体；而醋酸铀则引起一些杆状病毒的变形，如引起大麦条纹花叶病毒扭曲断裂，引起线虫传多面体病毒属一些成员膨胀或崩溃，一向认为很温和的染料钼酸铵也能引起悬钩子丛矮病毒的完全破坏和一些等径易变病毒组成员的部分降解。因此，必须常备多种染料（至少3～4种），采用两种以上染料同时染色同一样品。表2列出了植物病毒染色常用染料。染料最好3～4周更换一次，少量配制（如25ml），冰箱保存，以防氧化失效。
表2 植物病毒染色常用染料
pH调节用1mol/L HCl或1mol/L NaOH，而钼酸铵用醋酸铵调，甲酸铀用氢氧化铵调。
强大电子束的轰击，是造成病毒变形和失去结构细节的另一重要原因，观察时要采用尽量低亮度光斑，动作迅速，以减少轰击时间。Forvmor膜等在电子束照射下，容易漂移，这样病毒会被拉长或拉宽，因此，在测量病毒颗粒大小等精确观察时，最好使用碳膜，或在Forvmor膜上加喷一层碳膜。
（5）病毒粒体大小测量 目前病毒学工作者已经注意到，同一病毒的大小不一样，有些甚至相差甚远。这可能是由于不同分离物或不同株系本身就不同，但大部分可能是由于实验误差或方法上的差别造成的。测量病毒大小，一般不宜提纯病毒，而要用病株粗提液。因为病毒在提纯过程中的形态结构，会由于提纯过程中离子环境等的变化和物理因素的影响发生而变化。染色要用两种以上染料，测量病毒颗粒的数量要尽量多，尤其是线状病毒容易断裂，数量应在100个以上。
2.2 超薄切片技术
根据电镜成像原理可知，用于电镜观察样品其厚度要求在数十纳米，而通常单个细胞的厚度在数十微米，比要求厚度大100倍，而徒手切片或用于光镜的切片机，其切片厚度一般在单个细胞水平，所以电镜观察必须做超薄切片。
超薄切片一般程序为：取材—固定—脱水—包埋—切片—染色—电镜观察。
（1）取材 取材要求典型、迅速，机械损伤小。材料切成1mm3大小，离体后1min之内进入固定液。应取不同寄主材料、同一寄主的不同组织和不同接种时期的样品。
（2）固定 是用物理的或化学的方法迅速将细胞杀死，并且尽可能地使保存和固定细胞内各种结构、生物大分子生活时的状态和位置。电镜中常用的固定方法是化学固定。常用四氧化锇、戊二醛、高锰酸钾或重铬酸钾等固定剂。在病毒学中一般采用2%～3%戊二醛—1%～2%四氧化锇（用0.2mol/LPBS，pH7.2配制）双固定法，这样细胞中的多种成分，如蛋白质、脂类、多糖、核酸等，大部分都能固定下来。戊二醛固定12～24h，四氧化锇固定2～4h。戊二醛遇到锇酸会形成沉淀，因此戊二醛固定后一定要用缓冲液充分清洗后再进行四氧化锇固定。固定在超薄切片中很关键，固定液的种类、浓度、pH、渗透压、离子组成、固定时间、温度和方式都与固定的质量密切相关。因此，整个固定过程应该在4℃下进行。固定剂一定要用缓冲液配制。固定好的材料，电镜下细胞内各种膜系统应该完整，没有断裂，双层膜要基本平行，细胞质呈精细颗粒状，没有空白。固定后缓冲液要充分清洗后再进行下面的步骤。
（3）脱水 常用的包埋剂是疏水的，因此包埋前要用既亲水又亲脂的乙醇或丙酮进行脱水。从低浓度到高浓度的脱水剂脱水，最后用绝对无水的脱水剂脱水。
（4）包埋 包埋的目的是增强样品的机械强度，使样品具有一定的机械形状，适于切片机工作；另一个重要作用是进一步固定细胞结构。包埋剂种类很多，有水溶性的，也有脂溶性的。常用的是Epon812等环氧树脂。包埋过程中发生的化学反应，叫聚合过程。聚合过程中实际上发生了两类反应，一类是环氧树脂末端环氧基之间在胺类化合物（如DMP-30）催化下，化合生成长链；另一类是树脂中间的羟基和交联剂（也称固定剂）的酸酐发生反应，生成横向连桥，加固了树脂分子之间的联系。为了增强树脂聚合形成的包埋块的切割性能，常加入一些增塑剂，如树脂、催化剂、固化剂。
（5）切片 准确、熟练地掌握切片机操作技术，包埋块软硬适度，修块好，就能切出要求质量的片子来。这里技巧很重要。
（6）超薄切片的染色 也叫电镜技术的正染色。观察内容不一样，采用染色方法不同，病毒内含体和细胞病理学研究则常用醋酸双氧铀—柠檬酸铅染色法。切片在1%～2%醋酸双氧铀中染色20min，用50%乙醇冲洗后用柠檬酸铅染色30min，0.01mol/L NaOH冲洗。染色的关键是要防止醋酸铀和柠檬酸铅生成沉淀。防止污染的主要措施是防止CO2和柠檬酸铅反应。如用刚制备出的蒸馏水配制染料和冲洗剂，染色时在小室中进行，小室中放入吸收CO2的固体NaOH，防止人呼吸时CO2进入小室中，戴口罩等。染色和冲洗完毕，切片自然干燥后就可以电镜观察。
电子显微镜的出现及各种电镜技术的发展，为植物病毒的直接观察起到了巨大的推动作用，使检疫工作人员能得到受病毒感染的病毒粒子电镜照片以作为直接证据。但电镜观察结果需要和其他方法的检测结果相结合，才能确定病毒的分类地位。这是因为许多病毒都有类似的形态和结构。由于一些植物汁液中病毒浓度过低，在进行常规的电镜观察检测中，很难发现病毒粒子，这样就要求对一些植物病毒进行分离和提纯，以便进行有效的电镜观察和其他理化检测。病毒的分离和提纯主要是采用差速离心、PEG沉淀的方法，进一步的纯化则采用密度梯度离心和柱层析法。为了直接检测植物体内的带毒情况，常采用植物组织的超薄切片和电镜观察进行。超薄切片的电镜观察可以直接用于对植物组织内部的病毒形态、内含体形态、病毒所在的部位、受感染的植物组织发生的病理学变化等进行检查。
