Western Blottingwestern blotting 实验试剂

发布网友 发布时间：2024-10-24 08:33

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热心网友 时间：2024-11-14 18:07

在进行western blotting实验时，所需试剂包括以下几类：

1. 130%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺：将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。操作时需注意丙烯酰胺的神经毒性，应戴手套和面具。

2. 24×Tris·Cl/SDS,pH8.8：在300mlH2O中溶解91g Tris碱（1.5mol/L），用1mol/L调节pH至8.8，补加H2O至体积500ml。用0.45um滤膜过滤溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。

3. 34×Tris·Cl/SDS,pH6.8：在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L），用1mol/L调节pH至6.8，补加H2O至体积100ml。用0.45um滤膜过滤溶液，再加入0.4g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。

4. 4×SDS电泳缓冲液：Tris base 24.2 g，Glycerin 115.3 g，20%SDS 20 ml，加水至总体积1000ml。应用时稀释4倍即为1×SDS电泳缓冲液（Tris 0.05M,Glycerin 0.38M,SDS 0.1%）。

5. TEMED (N,N,N’，N’-四甲基乙二胺）：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺的聚合。

6. 10%过硫酸铵：提供驱动丙烯酰胺和亚甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去离子水配制小量10%(w/v）的贮存液并保存于4℃。由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如*纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。